環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定

環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定5/9/20241環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定一、開展微生物快速檢測工作的意義據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，在全世界每年數(shù)以億計的食源性疾病患者中，80％是由于食用了各種致病性微生物污染的食品和飲水造成的。2000年至2012年，中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所對全國部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水產(chǎn)品、蔬菜中的致病菌污染狀況的監(jiān)測結(jié)果表明，微生物性食物中毒仍居首位，占39.62％；化學(xué)性食物中毒占38.56％；動植物性和原因不明的食物中毒均占10％左右。傳統(tǒng)的微生物檢測方法，主要包括形態(tài)檢查和生化方法，涉及的實驗較多、操作繁瑣、需要時間較長、準(zhǔn)備和收尾工作繁多。5/9/20242環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定1955年德國學(xué)者F.J.Forg發(fā)明了一種簡單快速的大腸菌群快速檢測法—紙片法，使原來的檢測周期由72小時縮短到15小時，材料成本降低了四分之三，同時大大簡化了操作程序。從此，這種生化檢測方法開始發(fā)展起來。另外，將培養(yǎng)基固化在試劑盒中的速測盒法，也是一種較為簡潔快速的檢測方法，省去了大量的實驗準(zhǔn)備工作。5/9/20243環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定二、開展微生物快速檢測所需的基本條件一間通風(fēng)良好、面積不需要很大的獨(dú)立房間或野外帳篷；一個便攜式紫外線消毒燈；一臺便攜式恒溫培養(yǎng)箱；一個食品微生物快速檢測箱，箱內(nèi)備有實驗用的工具和器皿、檢測用測試片和試劑盒。有條件時，可增加一臺高壓鍋或紅外線消毒柜（家用消毒碗柜也可）；具備以上設(shè)備和無菌操作概念即可進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測了。5/9/20244環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定1.點燃酒精燈，營造局部無菌環(huán)境。取樣和加樣時盡量靠近酒精燈操作。操作工具如鑷子、剪子、長柄勺、小刀等，在酒精燈上用火焰消毒后使用。2.用75%酒精棉球?qū)⑹趾蜆悠烽_口處周圍抹擦消毒。3.將無菌袋或無菌器皿放在天平上，用無菌器皿拿取樣品稱量25g或25ml，加入225mL生理鹽水將樣品溶解，或?qū)悠贩湃胧⒂?25mL生理鹽水的均質(zhì)管中將樣品溶解（此為10倍樣品稀釋液），從中取1mL加入到無菌試管中，加入9mL生理鹽水，混勻（此為100倍樣品稀釋液），一般情況下，取原液和10倍及100倍樣品稀釋液進(jìn)行檢測。4.餐飲具衛(wèi)生狀況的檢測，按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB14934紙片法進(jìn)行。三、無菌操作和注意事項5/9/20245環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定四、常見微生物檢測項目常規(guī)微生物項目細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、霉菌及酵母菌致病微生物項目沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等5/9/20246環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定傳統(tǒng)計數(shù)改良法1、培養(yǎng)膜法2、螺旋平板計數(shù)法：螺旋接種儀＋菌落計數(shù)3、濾膜法：常用于一些可過濾樣品的檢測快速檢測的新方法1、ATP生物熒光法2、電阻抗法3、顏色變化4、流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)5、其它：熱量法，放射測量法五、常規(guī)微生物檢測方法5/9/20247環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定培養(yǎng)膜法-快速檢測紙片技術(shù)微生物測試片：是一種將脫水培養(yǎng)基附著于無無紡布棉墊上的即用型檢測產(chǎn)品。原理二片塑料膜構(gòu)成，上薄為蓋，下厚為培養(yǎng)基。操作方法：檢樣稀釋→取1ml滴于下膜正中央→蓋上膜→37℃培養(yǎng)24h→計數(shù)(顯色的斑點)計數(shù)：直接數(shù)出，若太多，可選擇幾個有代表性菌落的小方格分別計數(shù)，計算平均菌落數(shù)，再乘以20，即可得到整個測試片上估算的菌落數(shù)。

5/9/20248環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定培養(yǎng)膜法-快速檢測紙片技術(shù)優(yōu)點：可節(jié)約玻璃儀器、培養(yǎng)基?？晒?jié)省培養(yǎng)基等試劑的配置滅菌和玻璃儀器滅菌和清洗的時間、人力和費(fèi)用。因為有顯色劑和小方格，計數(shù)方便。節(jié)約稀釋的繁瑣動作?？煽焖贉y試致病菌，節(jié)省大量的實驗步驟。缺點成本比傳統(tǒng)方法要稍高些。測試細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌時不能節(jié)約培養(yǎng)時間。5/9/20249環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定培養(yǎng)膜法-快速檢測紙片技術(shù)應(yīng)用細(xì)菌總數(shù)測試片中含有一種紅色指示染劑，使所有菌落易認(rèn)別計數(shù),48h可群定菌數(shù)。大腸菌群測試片中含有指示劑，使菌落為藍(lán)色或藍(lán)綠色,24h可確定大腸菌群數(shù)。大腸桿菌指示劑可使所有菌落為紫色。24小時可確定大腸桿菌數(shù)。5/9/202410環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定霉菌和酵母菌計數(shù)測試片中加入的抗生素，可以抑制細(xì)菌生長；指示劑使酵母菌易認(rèn)別計數(shù)；霉菌可產(chǎn)生特有的色澤。金黃色葡萄球菌使用了具有熱穩(wěn)定的核酸酶反應(yīng)片，核酸酶反應(yīng)產(chǎn)生的粉紅色環(huán)帶色圍著一個紅色或蘭色菌落即為金黃色葡萄球菌，24小時可確認(rèn)結(jié)果。培養(yǎng)膜法-快速檢測紙片技術(shù)5/9/202411環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定測試片檢測結(jié)果圖像5/9/202412環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定5/9/202413環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀自動菌落計數(shù)儀5/9/202414環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定原理樣品制備的菌懸液在瓊脂表面形成阿基米德螺旋型軌跡。當(dāng)用于分液的空心針從平板中心移向邊緣時，菌液體積減少，注入的體積和瓊脂半徑間存在指數(shù)關(guān)系。培養(yǎng)時菌落沿注液線生長。用一計數(shù)的方格來校準(zhǔn)與瓊脂表面不同區(qū)域有關(guān)的樣品量，計數(shù)每個區(qū)域的已知菌落數(shù)，再計算細(xì)菌濃度。螺旋平板法5/9/202415環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動同時自動將樣品稀釋1000倍阿基米德螺旋型軌跡螺旋平板法5/9/202416環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定優(yōu)點與傳統(tǒng)方法相比，無需稀釋梯度，每個梯度倒2個平板，節(jié)省了大量人力物力。缺點檢測時間并沒有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時。需要配合自動菌落計數(shù)儀，否則人工計數(shù)更麻煩。螺旋平板法5/9/202417環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定濾膜法濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測。優(yōu)點靈敏度增大，菌落無擴(kuò)散情況，便于計數(shù)。缺點需要額外的支出購買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對菌數(shù)要求特別嚴(yán)格的產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。5/9/202418環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定ATP生物熒光法原理ATP＋螢光素+螢光素酶+O2—AMP+Ppi+CO2+氧化螢光素+光應(yīng)用用于食品生產(chǎn)線和管道進(jìn)行快速清潔程度檢測。用于水質(zhì)檢測。改良后用于食品的商業(yè)無菌檢測或終產(chǎn)品檢驗。5/9/202419環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定10秒獲得結(jié)果涂抹采樣混合:震蕩5s檢測表面清潔度/水質(zhì)檢測ATP生物熒光法5/9/202420環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定ATP法檢測成品的優(yōu)缺點優(yōu)點：大大縮短庫存時間，減少物流壓力和成本。缺點：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，有存在假陰性的可能。ATP生物熒光法5/9/202421環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)原理供細(xì)菌生長的液體培養(yǎng)基是電的良導(dǎo)體，在特制的測量管底部裝入電極插頭，即可對接種生長的培養(yǎng)基的阻抗變化進(jìn)行檢測。阻抗變化的產(chǎn)生是由于微生物生長過程中的新陳代謝使培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)(糖、脂類、蛋白質(zhì)等）被分解成小分子代謝物，即較小的帶電離子（乳酸鹽、醋酸鹽、重碳酸或氨等）這些代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)和聚集，增強(qiáng)了培養(yǎng)基的導(dǎo)電性能，從而降低了其阻抗值。5/9/202422環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定

M=(R0-RT)/R0×100%其中R0表示開始時培養(yǎng)基的阻抗值RT表示任意時刻培養(yǎng)基的阻抗值M表示培養(yǎng)基電阻減少的百分?jǐn)?shù)。電阻越小細(xì)菌活動越多，在一定范圍內(nèi)，菌落形成單位的對數(shù)Log(CFU)與IDT（阻抗檢測時間）呈直線關(guān)系。電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)5/9/202423環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定優(yōu)缺點：電阻抗法較省力，樣品細(xì)菌數(shù)在4～18小時內(nèi)出結(jié)果。但對于菌數(shù)太低的不好，樣品中還不能用防腐劑，否則結(jié)果是亂七八糟的。電阻抗法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線過程中工作量較大，但以后的檢測簡便的多，不需要一系列稀釋，只需樣品1ml，培養(yǎng)基9ml，測量管一只。電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)5/9/202424環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定通過顏色變化檢測微生物生長導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學(xué)檢測器檢測底部瓊脂層的顏色變化，記錄達(dá)到突變點的時間。與阻抗法類似，可以實現(xiàn)快速檢測。缺點：需要購買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。5/9/202425環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定致病菌快速檢測方法顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認(rèn)。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，熒光酶免、免疫磁分離等方法。分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測法和PCR法為主?；蛐酒?/9/202426環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定（一）顯色培養(yǎng)基法原理在選擇性培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上經(jīng)過改良。利用細(xì)菌特有的生理生化反應(yīng)，使培養(yǎng)基中的指示劑產(chǎn)生顏色變化，以將目標(biāo)菌與其他菌區(qū)別開來5/9/202427環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定（二）酶聯(lián)免疫技術(shù)—mini-Vidas全自動免疫分析儀利用熒光分析技術(shù)通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標(biāo)生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分沖洗，通過激發(fā)光源檢測，即能自動讀出發(fā)光的陽性標(biāo)本。優(yōu)點是檢測靈敏度高，速度快，可以在48小時的時間內(nèi)快速鑒定沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、單核李斯特菌，空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等。5/9/202428環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定（三）分子生物學(xué)方法基因探針法及PCR方法在國外已經(jīng)有相當(dāng)成熟的表現(xiàn)。有普通PCR，熒光PCR，實時熒光PCR（定量PCR）等多種方法?；蛱结樂ㄒ话阋残枰鼍缓蠹犹结樤噭╇s交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測器下獲得結(jié)果。PCR方法一般不需增菌太長時間，通過PCR方法對待測微生物的特征片斷進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過凝膠電泳或熒光PCR技術(shù)判斷結(jié)果。5/9/202429環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定優(yōu)缺點分子生物學(xué)方法檢測致病菌，特異性較強(qiáng)，技術(shù)較為前沿，特別是相對國標(biāo)方面來說。假陽性概率仍然較高，因此只能作為一種初篩方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出結(jié)果，與免疫法比沒有速度優(yōu)勢。目前不少產(chǎn)品已經(jīng)通過AOAC的認(rèn)證。（三）分子生物學(xué)方法5/9/202430環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定六、微生物檢測流程圖固體樣品：取1:10溶解稀釋液液體樣品：取原液致病菌檢測試劑盒36℃培養(yǎng)6h～18h如果某增菌液發(fā)生混濁即預(yù)示含有某種致病菌可將混濁的增菌液接種到相應(yīng)測試片上，36℃培養(yǎng)18～24h驗證結(jié)果1.食物中毒樣品的快速篩查5/9/202431環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定2.衛(wèi)生指示菌與致病菌的監(jiān)測固體樣品：取1:10、1:100或1:1000溶解稀釋液液體樣品：取原液、1:10或1:100稀釋液加入到各測試片或試劑盒中36℃培養(yǎng)根據(jù)各測試片或試劑盒的培養(yǎng)時間觀察檢測結(jié)果5/9/202432環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定5/9/202433環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定

加樣培養(yǎng)陽性陰性液體樣品：直接倒入試劑盒刻度處，培養(yǎng)18～24h觀察結(jié)果固體樣品：稀釋后按以上操作。七、試劑盒大腸菌檢測結(jié)果圖像5/9/202434環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測定§2.1環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)的快速檢測適用范圍：餐廳、賓館、飯店、食堂與個體攤點及其他直接入口的食品生產(chǎn)、加工和銷售單位的環(huán)節(jié)表面的檢測本次實驗檢測場所：冷菜間的砧板試劑：菌落總數(shù)測試片采樣方法：接觸法（涂抹實驗）1）揭開覆蓋薄膜，加1ml無菌生理鹽水于無紡布棉墊上，使棉