中藥指紋圖譜研究技術(中華中醫(yī)藥學會)

中藥指紋圖譜研究技術中華中醫(yī)藥學會中藥化學分會委員周玉新內

容一、中藥指紋圖譜技術概述二、中藥指紋圖譜研究指導原則三、指紋圖譜研究的相似度計算四、中藥指紋圖譜的研究方法與思路五、中藥指紋圖譜研究示例演示（實驗）一、中藥指紋圖譜技術概述（一）

中藥指紋圖譜與中藥質量（二）

中藥指紋圖譜研究方法學（三）

中藥指紋圖譜技術的發(fā)展1.中藥指紋圖譜與中藥安全、有效、穩(wěn)定的關系（一）

中藥指紋圖譜與中藥質量指紋圖譜穩(wěn)定性可控性安全性有效性2.國內中藥質量評價現(xiàn)狀

植物學方法：

植物化學方法：

分析化學方法：

藥理學方法：

分子生物學方法:原植物鑒定，顯微鑒定等理化鑒定儀器分析，色譜分析等

生物鑒定法，生物等效等

DNA指紋鑒定3.國外植物藥質量評價概況煉標準制劑：五味子銀杏

人參

西洋參甘草

黃芪

貫葉連翹煉定量測定結合主成分比例煉固定產地以生產質量恒定制劑煉多種分析手段和方法包括藥材、中間體等指紋圖譜4.中藥指紋圖譜的意義煉是全面反應中藥所含內在化學成分的種類與數(shù)量，進而反映中藥的質量，尤其在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確，采用中藥指紋圖譜的方式，將有效地表征中藥質量和穩(wěn)定性煉有利于中藥及其產品進入國際市場5.中藥指紋圖譜建立的原則煉系統(tǒng)性：煉特征性：煉穩(wěn)定性：指紋圖譜所反映的化學成分，應包括中藥有效部位所含大部成分的種類，或指標成分的全部指紋圖譜中反映的化學成分信息（具體表現(xiàn)為保留時間或位移值）是具有高度選擇性的，是這些信息的綜合結果指紋圖譜在規(guī)定的方法與條件下應能作出相對一致的指紋圖譜色譜特征的穩(wěn)定性：色譜條件穩(wěn)定性：特征峰特征區(qū)

特征參數(shù)不同儀器的驗證

不同實驗室的驗證不同操作者的驗證6.指紋圖譜研究目的☆品種鑒別--真?zhèn)巍罨磋b別--產地☆藥用部位的鑒別--根、莖、葉、花、果☆提取工藝☆藥材炮制☆限量成分的控制☆一致性--不同批次的產品.7.

建立中藥指紋譜所面臨的問題煉品種多、產地多;采收、加工不一致－化學組分與含量不同（產品品質優(yōu)劣不同）煉有效組分種類繁多、含量相對少；非有效組分成分復雜、含量高－分析檢測困難（質量控制指標不統(tǒng)一）煉基礎研究薄弱煉藥材GAP建設滯后8.

對

策煉加強GAP藥材種植基地建設煉加強中藥種植與加工、炮制的規(guī)范化煉加強中藥化學成分的基礎研究煉應用現(xiàn)代分析技術手段進行中藥指紋圖譜研究9.

中藥指紋譜研究過程中面臨的問題煉儀器設備煉技術人員煉研究經驗系統(tǒng)性問題穩(wěn)定性問題特征性問題（二）

中藥指紋圖譜研究方法學

色譜法液相色譜法（LC）氣相色譜法（GC）薄層掃描法（TLC）毛細管電泳法（CE）

其它質譜法（MS）及色譜與質譜聯(lián)用X-衍射法近紅外法（NIR）等（三）

中藥指紋圖譜技術的發(fā)展煉

應用范圍煉

儀器設備與軟件煉

指紋圖譜標準二、

中藥指紋圖譜研究指導原則（一）目的和要求（二）中藥指紋圖譜標準起草說明（三）中藥指紋圖譜標準的建立（一）目的和要求煉中藥質量研究和質量標準的一個重要內容煉加強中藥質量管理、提高中藥質量、保證藥品安全、有效、穩(wěn)定、可控煉固定原料藥（中藥材）品種、產地和采收季節(jié)的前提下，需制定原料藥(中藥材)和注射劑的指紋圖譜（二）中藥指紋圖譜標準起草說明名稱、漢語拼音按中藥的命名原則制定來源（產地、采收期、炮制）藥

材：產地、采收期、炮制中間體：提取工藝或提取物的來源供試品溶液的制備有效成分(專屬性成分、指標性成分)的理化性投質并結合檢測方法的要求提取工藝參照物溶液的制備 對照品內標物標準提取物中藥指紋圖譜檢測方法的驗證檢測方法測定方法、儀器、試劑、測定條件驗證專屬性（空白試驗）精密度試驗（RSD<3%）重復性與重現(xiàn)性試驗（S<0.95）穩(wěn)定性試驗（S<0.95）系統(tǒng)適應性試驗指紋圖譜的相關性（三）中藥指紋圖譜標準的建立注意事項所有成分應在2小時左右洗脫，并提供2小時的指紋圖譜可建立各個組分的指紋圖譜可建立多種方法的指紋圖譜可選擇典型樣品的指紋圖譜，或標準提取物的指紋圖譜，或具有代表性的勾兌樣品的指紋圖譜作為標準指紋圖譜2.指紋圖譜標準的建立（1）藥材、中間體指紋圖譜標準為企業(yè)內控標準，列入起草說明（2）10批供試品（3）標準的規(guī)定：供試品的指紋圖譜與對照提取物（標準提取物的指紋圖譜一致；或供試品的指紋圖譜與對照指紋圖譜（標準圖譜）一致；或通過對各特征峰的位置（相對保留時間、比移值等）、豐度（積分面積或峰高）及相對豐度、光譜特性（顏色）等綜合參數(shù)的描述予以確定。3.

指紋圖譜標準書寫格式液相色譜法【指紋圖譜】

照高效液色譜法（中國藥典一部附錄VID），結合指紋圖譜的要求測定。色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

如以對照品做系統(tǒng)適用性試驗，則參照中國藥典書寫格式。如以隨行對照提取物做系統(tǒng)適用性試驗，則只書寫所用儀器、色譜柱型號及有關參數(shù)和各項具體試驗條件。對照品溶液的制備供試品溶液的制備如有對照品則照中國藥典書寫格式。精密吸取供試品溶液、對照品溶液（或對照用提取物溶液）各XX

l，分別流入液相色譜儀，測定。本品指紋圖譜的主要特征

供試品指紋圖譜與質量標準所附的對照指紋圖譜（或隨行對照提取物指紋圖譜）經計算軟件計算，相似度大于

XX，符合要求（或相似度小于

XX，不符合要求）。三、指紋圖譜研究的相似度計算（一）、指紋圖譜相似度評價原則與方法（二）、指紋圖譜相似度計算原理（三）、指紋圖譜相似度評價軟件（一）、指紋圖譜相似度評價原則與方法原則：整體性、模糊性、特征性方法：直接觀察、計算機輔助相似性計算（二）、指紋圖譜相似度計算原理引用參數(shù)數(shù)據(jù)獲取途徑相似度算法1.

引

用

參

數(shù)①保留時間(RT)②峰高(He

i

ght)③峰面積(Ar

ea)④峰面積百分比（Ar

ea%）⑤相對保留時間（Ra

t

i

o

of⑥積分相對比值（Ra

t

i

oofRe

t

ent

i

on

Ti

me

,

RRt

）Ar

ea,

RA）2.

數(shù)據(jù)獲取途徑圖形/圖像轉化成ASCI

I數(shù)據(jù)截片數(shù)據(jù)色譜數(shù)據(jù)3.

相

似

度

算

法相關系數(shù)算法夾角余弦算法優(yōu)化算法（三）、指紋圖譜相似度評價軟件軟件開發(fā)原則市售/常用軟件簡介相似度軟件使用過程中應注意的問題1.

軟

件

開

發(fā)

原

則(1)

系統(tǒng)獨立性(2)計算方法的科學性

(3)數(shù)據(jù)接口通用性(4)操作過程及應用的實用性2.

市售/常用軟件簡介(1)浙江大學(2)中南大學陳一宇教授梁逸增教授(

3)

沈陽藥科大學

畢開順教授李華教授(4)西北大學(5)二軍大

(6)Wa

t

er

s3.

相似度軟件使用過程中應注意的問題(1)

數(shù)據(jù)接口與數(shù)據(jù)類型(2)

數(shù)據(jù)的校正(3)

算法的選擇四、中藥指紋圖譜的研究方法與思路（一）、研究方案設計（二）、樣品的選擇與收集（三）、供試品的制備（四）、指紋圖譜色譜條件研究的思路（五）、相似度值的研究與指紋特征（一）、研究方案設計資料收集與整理文獻、工藝資料、質量標準方案的設計研究對象-有效成分研究方法的選擇-色譜法(HPLC

GC

TLC)及其它方法研究內容-根據(jù)技術要求的規(guī)定：包括“名稱、來源、制備、檢測方法、標準規(guī)定及起草說明”（二）、樣品的選擇與收集要求：10個批次道地藥材與GAP基地藥材典型性與代表性離散樣品的剔除（三）、供試品的制備依據(jù)：有效組分的物理化學性質生產或提取工藝檢測方法的需要（四）、指紋圖譜色譜條件研究的思路高效液相色譜法

HPLC氣相色譜法

GC1.高效液相色譜法HPLC檢測波長的選擇

（簡）柱溫的選擇

（略）進樣量

（簡）色譜柱的選擇

（重點）檢測成分的選擇

（重點）流動相（梯度表）的選擇

（重點）（1）

檢測波長的選擇示例：蜂膠(Be

e

Pr

opol

i

s)m

in1

02

03

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A

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07

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A

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2

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,

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2

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05

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07

002

0

04

0

06

0

0波長選擇：=280nm（4）

色譜柱的選擇選用市場上較常見的填料所填充的色譜柱，例如：E

k

a-Nob

e

l的

K

r

oma

s

i

C18(5

m)，其分離效果好、性能穩(wěn)定，無論是國產填充的

Kromasi色譜柱，還是國外公司填充的Kromasi色譜柱，在分離效果上基本相同。因此對于大多數(shù)中藥注射劑，可選用Kromasi色譜柱。如選用乙腈-緩沖溶液，應根據(jù)緩沖溶液的特點，選用相應的色譜柱：①如為酸性緩沖溶液，可選用Zor

baxSB-C18色譜柱（pH<2）；②如為堿性緩沖溶液，可選用Eclipse

XDB-C18色譜柱（pH>6）。示例：不同的色譜柱對三七總皂苷的分離效果3

0

04

0

05

0

0VWD1A,

Wa

ve

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ve

le

ng

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nm

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ve

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nm

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.D)*VWD1

A,

Wa

ve

le

ng

th=203

nm

(S

ANQI\A2112502

.D)mAU140mi0102030405060700204060（5）

檢測成分的選擇（重點）示例：何首烏1

0

0

01

5

0

02

0

0

02

5

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A,

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ve

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WF

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.

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1

1

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.

.

.

.

.

.

.

.

.

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.

.

.

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1

1

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1

1

1

1

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3

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2

2

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.

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4

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6

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9

9.

.

.

.

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1

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4

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3

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9

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0

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2

2

2

2

2

2

25

42

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4

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8

525.

.

.

.

.

.

.

.

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2

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.

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29

894

95

209

013011031.

.

.

.

..531

0.239035.20246.83150.94951.696何首烏生品的液相色譜圖（全局圖）1

0

01

5

02

0

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A,

Wa

ve

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05

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011.12715.55317.66220.21422.33325.83451.696何首烏生品的液相色譜圖（局部放大圖）min01

02

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05

005

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120.75621.15322.00423.42724.20325.50126.19631.12035.25246.625m

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02

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AU10.13911.52114.02114.71515.29815.87817.20717.54618.39618.80220.01220.99225.98530.984.54251.388m

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ve

le

ng

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.D)m

AU10.18111.53714.03614.73315.32517.22218.41118.81120.02620.99525.97730.9766.54051.374m

in01

02

03

04

05

005

01

0

01

5

02

0

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A,

Wa

ve

le

ng

th=2

9

6

nm

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WF

P

1

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9

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3

1

7

.D)m

AU10.15611.52114.7121589117.21617.55518.40118.79320.03421.00826..01631.01251.369m

in01

02

03

04

05

005

01

0

01

5

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0

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1

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8

.

D)m

AU2.5092.7611021411.

.5421314..20244915.33915.91417.22517.56718.40318.79720.03720.59721.00421.87223.24226.00731.00751.357m

in01

02

03

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1

.4

.

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4.

.

7

13

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42

82

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215.91116.3816.90717.23517.568

518.418

1.

579519.24919.8209.026120.60821.01621.88523.2392363024.07.530.99246.60751.553m

in01

02

03

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05

005

01

0

01

5

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0

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A,

Wa

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ng

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9

6

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2

1

.

D)m

AU2.5392.78310.43811.11411.73412.82513.48313.94414.4941

15

4.

.3

91

84

316.17116.6727.15517.5561

17.95418.78319.26420.38321.07921.49522.36323.45523.8432449825.

.86926.62831.22951.756m

in01

02

03

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05

005

01

0

01

5

02

0

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A,

Wa

ve

le

ng

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9

6

nm

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1

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3

2

2

.D)m

AU2.5782.81010.67511.21111.95113.0581314.3

.8066014.71915.280171

16

6.

.4

0

55

9

.80

1017.17.

0421817.88518.226

619.11519.76822

00

.4.6

41

6321.41721.82123.71324.18826.83231.30751.830m

in01

02

03

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0

01

5

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0

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A,

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9

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WF

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1

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2

3

.

D)m

AU2.5942.81910.71511.24511.99413.10611

33

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42

354741.318184216.

11

556

.51

1659417.0

.

.5717.43317.9251.118.

872

22

519196419.18

.176112472

00

.64

4421.

.

.48221.88723.75824.26846.96451.876m

in01

02

03

04

05

0m

AU05

01

0

01

5

02

0

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D

1

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9

6

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3

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4

.

D)16.56017.92319.152195319..

688021.46821.86623.71724.27531.41747.05352.010圖9上海制首烏指紋圖譜m

in01

02

03

04

05

0m

A

U05

01

001

502

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D

1

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W

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.

D

)1600217.

.17218.12619.37320.22222.11022.74824.48646.919北京良方藥業(yè)制首烏m

in0102

0304050m

AU0501

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D

)4.19510.64411.9381

12

2.

.4

213.

7

3047

7313.9514232145

41

1

153

0

8

4

.9

8

77

1

8

115.41

.

.

.

.6

8.

2

116468516911

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8

7

1111

2

5

09

1

79

6

.

38

0

.1

1

1

19

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9

8.

.

.9

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.

8

7

14

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.

8

.95

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.408

24

04

.5321.36221.

.7742

22.5252

23

3.

.7

35

39

024.70626.67627.76531.44747.074北京金象藥店制首烏m

A

U1

5

02

0

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1

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,

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3

3

6

.

D

)13.918min01

02

03

04

05

005

01

0

02.83310.60911.22611.50011.90321.694北京壽春堂藥店制首烏指紋圖譜（6）

流動相（梯度表）的選擇主要影響因素起始濃度梯度速率流速梯

度

表指紋圖譜流動相梯度優(yōu)化時間顱min水%（H+/OH-）*乙腈%*Ⅰ01000552080600100Ⅱ01000407030606040Ⅲ08020406040605050Ⅳ06040403070600100*為體積百分比（V/V）初始色譜條件時間（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000600100時間（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000552080600100初始色譜條件的設定依據(jù)及目的依據(jù)：化合物極性大小。如未知時，假設有效組分中包含各種極性的成

分。目的：快速確定主要或大部分化合物被洗脫時流動相的組成，為優(yōu)化條件的選擇提供依據(jù)。優(yōu)化條件的選擇選擇依據(jù)：初始色譜圖、梯度洗脫表及一定的經驗示例：（1）淫羊藿總黃酮（40%）提取物鉤藤總生物堿黃連藥材知母總皂苷1

5

0

02

0

0

02

5

0

0VWD1

A,

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7

2

nm

(ZZZ\A2

0

7

1

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2

4

.D)m

AU3

0

0

0min01

02

03

04

05

005

0

01

0

0

0淫羊藿提取物在初始條件下的色譜圖1

5

0

02

0

0

0VWD1

A,

Wa

ve

le

ng

th=2

7

2

nm

(ZZZ\A2

0

7

1

1

2

6

.D)m

AU2

5

0

0min01

02

03

04

05

005

0

01

0

0

0淫羊藿提取物第一次優(yōu)化后的色譜圖梯度速率：初始：100/60min=1.7/min優(yōu)化：0~1.7CH3CN%CH3CN%MinMin初始條件CH3CN%CH3CN%Min三七人參西洋參Min起始濃度：根據(jù)初始色譜圖中主要色譜峰被洗脫時的流動相組成，相應減少~20%。流速：0.5~2.0

ml/min2.

氣相色譜法（1）影響色譜峰分離程度的因素色譜柱的類型載氣流速起始柱溫升溫速率（2）研究示例樣品：廣藿香油指紋圖譜研究過程方案設計1.檢測方法色譜方法廣藿香油為廣藿香藥材經水蒸汽蒸餾而得到的揮發(fā)油，均為易揮發(fā)組分，擬采用氣相色譜法（GC）。儀器：Agi

l

ent

6890

GC色譜柱的選擇可供選擇的色譜柱：極性

非極性

中等極性進樣方式的確定手動

自動

頂空2.

供試品溶液的制備取廣藿香油適量，加醋酸乙酯溶解，即得。注：對于非極性毛細管色譜柱，如供試品溶液中含少量的少，最好干燥后進樣。2.

色譜條件的摸索（1）對梯度速率及流速進行微調-由粗到精F

ID1

A,

(GHX_TE

S

T\C3

0

9

1

3

0

0

.D)pA1

0

00

0初始條件流速：進樣口溫度：檢測口溫度：初始柱溫：升溫速率：3.02502805030ml/min℃℃℃℃/min24681

01

21

41

6

min020

0

040

0

060

0

080

0

0第一次優(yōu)化流

速：2.0ml/min進樣口溫度：250℃檢測口溫度：280℃初始柱溫：50℃升溫速率：20℃/minmin24681

01

21

41

61

801

0

0

02

0

0

03

0

0

04

0

0

05

0

0

06

0

0

0F

ID1

A,

(GHX_TE

S

T\C3

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9

1

3

0

1

.D)pA7

0

0

0第二次優(yōu)化流

速：1.0ml/min進樣口溫度：250℃檢測口溫度：280℃初始柱溫：50℃升溫速率：10℃/minF

ID1

A,

(GHX_TE

S

T\C3

0

9

1

3

0

2

.D)pAmin51

01

52

02

550

01

0

0

01

5

0

02

0

0

02

5

0

0第三次優(yōu)化流

速：1.0ml/min進樣口溫度：250℃檢測口溫度：280℃初始柱溫：50℃升溫速率：5℃/minmin51

01

52

02

5