《馬傳染性貧血診斷技術GBT+17494-2023》詳細解讀

《馬傳染性貧血診斷技術GB/T17494-2023》詳細解讀contents目錄1范圍2規(guī)范性引用文件3術語和定義4縮略語5實驗室生物安全措施6臨床診斷7樣品采集、保存與運輸contents目錄8實時熒光PCR9病毒分離與鑒定10瓊脂凝膠免疫擴散試驗11間接ELISA12競爭ELISA13免疫印跡試驗14綜合判定附錄A(規(guī)范性)試劑的配制contents目錄附錄B(資料性)實時熒光PCR引物和探針附錄C(資料性)實時熒光PCR陽性對照質粒的制備011范圍03驢雖然驢相較于馬和騾感染幾率略低，但仍存在感染風險，因此也應納入診斷技術應用的范圍。01馬作為馬傳染性貧血病的主要感染對象，診斷技術應重點針對馬進行檢測。02騾作為馬與驢的雜交后代，騾也可能因遺傳易感性而感染該病，需納入診斷范圍。診斷技術應用的馬種范圍養(yǎng)殖場大型養(yǎng)殖場中馬匹密集，一旦發(fā)生疫情將迅速傳播，因此需定期應用診斷技術進行篩查。交易市場在馬匹交易過程中，為確保交易安全，需對交易馬匹進行馬傳染性貧血病的診斷。進口檢疫為防止境外馬傳染性貧血病疫情傳入國內，需在進口環(huán)節(jié)對馬匹進行嚴格檢疫，應用診斷技術進行檢測。診斷技術的適用場景疫情監(jiān)測通過定期應用診斷技術，及時發(fā)現(xiàn)疫情，為采取有效的防控措施提供依據(jù)。凈化種群通過診斷技術對感染馬匹進行篩查和淘汰，逐步凈化種群，降低疫情傳播風險。保障馬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展馬傳染性貧血病對馬產(chǎn)業(yè)危害極大，應用診斷技術有助于及早發(fā)現(xiàn)和控制疫情，保障馬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。診斷技術的目標與意義022規(guī)范性引用文件診斷技術依據(jù)本標準診斷技術主要依據(jù)《中華人民共和國動物防疫法》和相關馬傳染性貧血病診斷技術規(guī)程。引用國內外關于馬傳染性貧血病的最新研究成果和診斷經(jīng)驗，確保診斷技術的科學性和先進性。對馬傳染性貧血病相關的術語進行規(guī)范，如病毒、抗體、檢測等，確保讀者對專業(yè)術語的準確理解。界定診斷技術的適用范圍和診斷對象，明確技術應用的具體場景。相關術語和定義診斷方法與技術要求01詳細描述馬傳染性貧血病的臨床診斷方法，包括癥狀觀察、病理剖檢等，為初步診斷提供依據(jù)。02闡述實驗室診斷方法，如血清學檢測、病原學檢測等，確保診斷結果的準確性和可靠性。對診斷過程中所需的技術要求、儀器設備、試劑耗材等進行規(guī)范，保障診斷工作的順利進行。03033術語和定義定義馬傳染性貧血是由反錄病毒科慢病毒亞科中的馬傳染性貧血病病毒引起的馬、騾、驢的傳染病。簡稱馬傳貧（EIA）特征間歇性發(fā)燒、消瘦、進行性衰弱、貧血、出血和浮腫。無燒期間癥狀逐漸減輕或暫時消失。馬傳染性貧血病原體馬傳染性貧血病病毒屬于反錄病毒科慢病毒亞科，是該病的致病原。概述病原學檢測觀察馬匹的臨床癥狀，如發(fā)熱、消瘦、衰弱等，進行初步診斷。臨床檢查通過病理解剖和組織學檢查，觀察組織器官的病變特征，進一步確診。病理學檢查利用血清學方法檢測馬匹血清中的特異性抗體，輔助診斷。血清學檢測0201030405診斷技術診斷技術包括臨床檢查、病理學檢查、血清學檢測和病原學檢測等方法，用于確診馬傳染性貧血病例。采用病毒分離、鑒定和核酸檢測等方法，直接檢測病原體，為確診提供有力證據(jù)。044縮略語縮略語的定義縮略語是指在特定領域或行業(yè)內，為了簡化表達而采用的一種簡短、具有代表性的詞語或詞組。在《馬傳染性貧血診斷技術》中，縮略語主要用于指代特定的技術、方法、疾病等，以提高文本的簡潔性和易讀性。VS本書中使用了多個縮略語，如ELISA、AGID、CF等，分別代表不同的診斷技術或方法。讀者在閱讀本書時，應注意理解并熟悉這些縮略語的含義，以便更好地理解和掌握相關技術。縮略語在本書中的應用縮略語的命名通常遵循一定的規(guī)則，如取詞組中每個單詞的首字母、采用特定縮寫形式等?？s略語具有簡潔明了、易于記憶等特點，但同時也可能因語境不明確而導致理解上的困難。因此，在使用縮略語時應注意給出其全稱或解釋，以避免產(chǎn)生歧義?？s略語的命名規(guī)則與特點如何準確理解和運用縮略語在閱讀《馬傳染性貧血診斷技術》時，讀者應結合上下文語境準確理解縮略語的含義。當遇到不熟悉的縮略語時，可查閱相關資料或向專業(yè)人士請教，以確保準確理解和運用。在實際工作中，可根據(jù)需要合理使用縮略語，以提高溝通效率和準確性。但應注意避免過度使用或濫用，以免引發(fā)誤解或混淆。055實驗室生物安全措施03實驗室應設立專門的樣本接收、處理和儲存區(qū)域，避免交叉污染。01實驗室應合理布局，劃分為清潔區(qū)、半污染區(qū)和污染區(qū)，并設置明顯的標識。02實驗室應配備符合要求的生物安全柜、通風系統(tǒng)、消毒設備等，確保實驗操作的安全性。實驗室設計與設施要求實驗室人員應接受專業(yè)的生物安全培訓，熟悉并掌握相關操作規(guī)程和應急處置措施。實驗室應建立人員健康監(jiān)測制度，定期對實驗人員進行體檢，確保人員身體健康。實驗室應制定嚴格的人員出入管理制度，控制非實驗人員進入實驗室。實驗室人員培訓與管理實驗室操作規(guī)范與廢棄物處理實驗室應制定詳細的操作規(guī)范，包括樣本采集、運輸、處理、檢測等各個環(huán)節(jié)，確保實驗結果的準確性。實驗過程中產(chǎn)生的廢棄物應嚴格按照相關規(guī)定進行分類、包裝、標識和處置，防止對環(huán)境和人員造成危害。0102實驗室應急預案與事故處置一旦發(fā)生實驗室生物安全事故，應立即啟動應急預案，采取有效措施控制事態(tài)發(fā)展，并及時向上級部門報告。實驗室應制定完善的應急預案，明確應急處置程序，定期組織演練，提高應對突發(fā)事件的能力。066臨床診斷馬傳貧病毒感染后，病馬常出現(xiàn)間歇性發(fā)熱，體溫可高達40℃以上，持續(xù)數(shù)天后消退，之后可能再次發(fā)熱。間歇性發(fā)熱隨著病情發(fā)展，病馬逐漸消瘦，肌肉萎縮，呈現(xiàn)進行性衰弱的癥狀。消瘦與衰弱病馬可出現(xiàn)貧血癥狀，如結膜蒼白等。同時，可能伴有鼻出血、便血等出血癥狀。貧血與出血在病情后期，病馬可能出現(xiàn)腹部、胸部或四肢的浮腫。浮腫6.1臨床癥狀觀察通過檢查病馬的血液常規(guī)指標，如紅細胞、白細胞和血小板數(shù)量等，可輔助診斷馬傳貧。采用特定的血清學方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等，檢測病馬血清中的馬傳貧病毒抗體，以確診感染情況。血常規(guī)檢查血清學檢測6.2血液學檢查組織病理學檢查通過采集病馬的組織樣本進行病理學檢查，觀察組織細胞的病變特征，為馬傳貧的診斷提供重要依據(jù)。免疫組化染色利用免疫組織化學技術對組織樣本進行染色，以顯示病毒抗原在細胞中的分布和定位情況，有助于確診馬傳貧。6.3病理學診斷6.4鑒別診斷馬傳貧的臨床癥狀與其他一些馬病相似，如馬流感、馬腺疫等。因此，在臨床診斷過程中需進行仔細鑒別，以確保準確診斷。與其他馬病的鑒別在鑒別診斷過程中，可借助實驗室檢測手段，如病原學檢測、分子生物學檢測等，以明確診斷結果。實驗室檢測的輔助作用077樣品采集、保存與運輸采集部位通常選擇馬匹的靜脈血液作為樣品，也可根據(jù)需要采集其他組織樣本，如淋巴結、脾臟等。采集量根據(jù)實驗需求和樣品保存條件，合理確定采集量，確保樣品數(shù)量和質量滿足后續(xù)檢測和分析要求。采集時間在馬傳染性貧血病毒感染的急性期、潛伏期和慢性期分別采集樣品，以全面了解病毒在不同感染階段的分布情況。樣品采集保存條件將樣品置于適當?shù)臏囟葪l件下保存，通常是在-80℃的超低溫冰箱中，以保持樣品的穩(wěn)定性和延長保存時間。保存記錄詳細記錄樣品的采集時間、地點、數(shù)量及保存情況等信息，便于后續(xù)追溯和管理。保存容器選擇無菌、密封性好的容器保存樣品，以防止樣品外泄和污染。樣品保存樣品運輸根據(jù)實際情況選擇適當?shù)倪\輸方式，如冷鏈運輸?shù)?，以確保樣品在運輸過程中的安全性和穩(wěn)定性。運輸標識在樣品包裝上標明相關信息，如樣品名稱、數(shù)量、采集時間等，方便識別和交接。運輸記錄對運輸過程進行詳細記錄，包括起運時間、到達時間、運輸途中的溫度變化情況等，以確保樣品運輸?shù)目勺匪菪?。運輸方式088實時熒光PCR利用熒光信號實時監(jiān)測PCR反應過程通過熒光染料或熒光探針與PCR產(chǎn)物結合，實現(xiàn)定量檢測熒光信號的強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，可準確反映樣本中目標基因的拷貝數(shù)實時熒光PCR技術原理能夠檢測出極低濃度的病毒核酸，提高診斷準確性高靈敏度針對馬傳貧病病毒的特定基因序列設計引物和探針，避免與其他病原體的交叉反應高特異性整個PCR反應過程自動化程度高，縮短診斷時間，同時操作簡便，降低技術人員的工作強度快速簡便實時熒光PCR在馬傳貧病診斷中的應用實時熒光PCR技術的優(yōu)勢與局限性優(yōu)勢實時監(jiān)測、高靈敏度、高特異性、定量準確等局限性對實驗條件和操作人員技術要求較高，需要專業(yè)的實驗室設備和經(jīng)驗豐富的技術人員才能進行操作和結果解讀實時熒光PCR技術通過實時監(jiān)測熒光信號，避免了傳統(tǒng)PCR后的電泳檢測步驟，簡化了操作流程，同時提高了定量準確性實時熒光PCR技術直接檢測病毒核酸，不受病毒抗體產(chǎn)生的干擾，可更早地檢測出病毒感染，為早期診斷提供有力支持實時熒光PCR技術與其他診斷方法的比較與血清學診斷方法相比與傳統(tǒng)PCR相比099病毒分離與鑒定采集樣品采集疑似感染馬傳染性貧血病的馬、騾、驢的血液或其他組織樣品。樣品處理對采集的樣品進行適當處理，如去除雜質、離心等，以獲得較為純凈的病毒樣品。接種易感細胞將處理后的病毒樣品接種到易感細胞上，如馬胎腎細胞，進行病毒分離培養(yǎng)。病變觀察持續(xù)觀察細胞病變情況，記錄病毒在細胞中的增殖情況。病毒分離方法利用電子顯微鏡觀察病毒的形態(tài)結構，確定其符合馬傳染性貧血病病毒的形態(tài)特征。形態(tài)學鑒定通過測定病毒的生物學特性，如血凝性、細胞病變效應等，進一步確認病毒種類。生物學特性鑒定采用PCR、基因測序等分子生物學技術，對病毒進行基因層面的鑒定和分析。分子生物學鑒定病毒鑒定技術陽性結果01若樣品中分離出病毒，且經(jīng)過鑒定確認為馬傳染性貧血病病毒，則表明該樣品為陽性，即該動物感染了馬傳染性貧血病。陰性結果02若樣品中未分離出病毒，或分離出的病毒不符合馬傳染性貧血病病毒的特征，則表明該樣品為陰性，即該動物未感染馬傳染性貧血病。鑒定意義03病毒分離與鑒定是確診馬傳染性貧血病的重要手段，對于及時采取防控措施、控制疫情擴散具有重要意義。同時，也為深入研究該病毒的致病機理和疫苗研制提供了有力支持。鑒定結果解讀1010瓊脂凝膠免疫擴散試驗試驗原理瓊脂凝膠免疫擴散試驗是一種基于抗原抗體反應的定性試驗方法。該試驗利用瓊脂凝膠作為介質，使抗原和抗體在凝膠中擴散并相遇，形成特異性沉淀線，從而判斷樣本中是否存在馬傳染性貧血病病毒抗原。03在一定的溫度和濕度條件下，觀察并記錄特異性沉淀線的出現(xiàn)情況。01制備瓊脂凝膠板，并打孔以便加入樣本和抗體。02向孔中加入待檢樣本和已知抗體，使抗原抗體在凝膠中自由擴散。操作步驟結果解讀若在待檢樣本與已知抗體之間形成清晰的沉淀線，則表明樣本中存在馬傳染性貧血病病毒抗原，結果判定為陽性。若未形成沉淀線或沉淀線模糊不清，則表明樣本中不存在或僅有極低濃度的病毒抗原，結果判定為陰性。注意事項01制備瓊脂凝膠板時需嚴格控制瓊脂濃度、pH值等條件，以保證試驗的準確性和可重復性。02加入樣本和抗體時應避免氣泡的產(chǎn)生，以免影響沉淀線的觀察。試驗過程中需保持規(guī)定的溫度和濕度條件，以確保抗原抗體反應的正常進行。031111間接ELISA間接ELISA是一種酶聯(lián)免疫吸附測定方法，用于檢測馬傳染性貧血病毒抗體。該方法利用酶標記的抗抗體（如酶標二抗）來識別與病毒抗原結合的特異性抗體，從而形成抗原-抗體-酶標二抗復合物。加入底物后，酶催化底物產(chǎn)生顏色反應，通過測定光密度值來定量檢測樣本中的抗體水平。主要包括抗原包被、樣本加入、酶標二抗加入、底物顯色和結果判定等步驟?？乖皇菍⒉《究乖潭ㄓ诠滔噍d體上；樣本加入是讓待測血清中的特異性抗體與固相抗原結合；酶標二抗加入則是形成抗原-抗體-酶標二抗復合物；底物顯色后，通過測定光密度值來判斷結果。原理操作步驟原理與操作步驟優(yōu)點間接ELISA方法具有較高的敏感性和特異性，能夠準確檢測馬傳染性貧血病毒抗體。同時，該方法操作簡便、快速，適用于大規(guī)模樣本篩查和臨床診斷。此外，間接ELISA方法還可以用于評估疫苗免疫效果和流行病學調查等方面。局限性雖然間接ELISA方法具有諸多優(yōu)點，但也存在一定的局限性。例如，該方法可能受到樣本中其他物質的干擾，導致假陽性或假陰性結果的出現(xiàn)。此外，不同廠家生產(chǎn)的試劑和酶標二抗可能存在差異，從而影響檢測結果的準確性和可比性。因此，在實際應用中需結合其他診斷方法進行綜合判斷。優(yōu)點與局限性應用范圍間接ELISA方法在馬傳染性貧血病的診斷、疫苗免疫效果評估以及流行病學調查等方面具有廣泛的應用價值。通過定期檢測馬群中的抗體水平，可以及時發(fā)現(xiàn)并控制疫情的傳播，保障馬匹的健康和安全。0102前景展望隨著生物技術的不斷發(fā)展和進步，間接ELISA方法將不斷完善和優(yōu)化，提高檢測的準確性和效率。同時，該方法還有望與其他新型診斷技術相結合，形成更加完善的馬傳染性貧血病診斷體系，為馬匹的健康和疫病防控提供更加有力的技術支持。應用范圍與前景展望1212競爭ELISA競爭ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是一種基于抗原抗體特異性反應的免疫學檢測方法。在馬傳貧病診斷中，利用酶標記的抗原與待檢血清中的抗體進行競爭性結合，通過酶催化底物顯色來判斷結果。原理該方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、結果可定量等優(yōu)點，適用于大規(guī)模樣本篩查和早期診斷。特點原理與特點操作步驟樣本采集與處理采集待檢馬匹的血液樣本，分離血清，并按要求進行保存和運輸。試劑準備準備所需的抗原、酶標抗原、抗體、底物等試劑，并按說明書進行配制。加樣與溫育將待檢血清和酶標抗原分別加入反應孔中，與固相抗體進行競爭性結合。之后進行溫育，使抗原抗體反應充分進行。洗滌與顯色溫育結束后，洗去未結合的成分，加入底物進行顯色反應。觀察反應孔的顏色變化，并根據(jù)需要進行終止反應。結果判定根據(jù)反應孔的顏色深淺或吸光度值來判定結果。通常設定陽性對照和陰性對照，以確保結果的準確性。競爭ELISA方法具有較高的靈敏度，能夠在馬傳貧病感染早期檢測出病毒抗體，為及時采取防控措施提供依據(jù)。早期診斷通過定期對馬群進行競爭ELISA檢測，可以及時發(fā)現(xiàn)并處理疫情，防止病毒擴散和傳播。疫情監(jiān)測在疫苗接種后，利用競爭ELISA方法檢測馬匹體內的抗體水平，可以評估疫苗的保護效果，為制定科學的免疫程序提供依據(jù)。疫苗效果評估應用價值1313免疫印跡試驗免疫印跡分析是一種基于免疫化學技術檢測蛋白質的方法，通過特異性抗體識別并檢測固定在固相載體上的蛋白質。電泳分離根據(jù)蛋白質的分子量、分子大小、電荷和等電點等性質，采用電泳方法進行分離。轉移到固相載體將電泳分離后的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上，以便后續(xù)抗體檢測。試驗原理封阻在加入一抗前，使用非特異性蛋白對膜進行封阻，以防止抗體與膜的非特異性結合。樣品制備根據(jù)實驗需求，選擇適當?shù)碾娪痉椒▽悠愤M行分離。電轉移采用半干法或濕法將蛋白質從凝膠轉移到固相載體上，注意控制通電時間和條件?？贵w孵育加入特異性抗體（一抗）與目的蛋白進行特異性結合，然后加入標記的二抗以進一步檢測。結果檢測根據(jù)實驗需求，選擇適當?shù)臋z測方法對結果進行定性或定量分析。操作步驟基礎研究用于蛋白質組學、信號轉導、基因表達調控等生物學領域的研究。藥物研發(fā)輔助新藥研發(fā)過程中候選藥物的篩選和評估。醫(yī)學診斷應用于疾病相關生物標志物的檢測，如腫瘤、自身免疫性疾病等。應用范圍注意事項抗體選擇確保所選抗體具有高特異性和親和力，以降低非特異性結合和背景噪聲。實驗操作規(guī)范遵循實驗室安全規(guī)范，確保實驗結果的準確性和可靠性。數(shù)據(jù)解讀結合實驗設計和目的，合理解讀實驗結果，避免誤判和誤導。1414綜合判定接觸史調查涉病馬匹近期是否與感染馬匹有過接觸，如共同放牧、同槽飼養(yǎng)、運輸?shù)?。疫苗接種情況了解涉病馬匹是否接種過馬傳染性貧血疫苗，以及疫苗接種的時間和效果。疫情歷史了解當?shù)鼗蛳嚓P區(qū)域是否有馬傳染性貧血的疫情歷史，包括疫情發(fā)生時間、地點、規(guī)模等。流行病學調查觀察馬匹是否出現(xiàn)間歇性發(fā)燒癥狀，記錄發(fā)燒持續(xù)時間和間歇期。間歇性發(fā)燒消瘦與衰弱貧血與出血浮腫注意馬匹是否出現(xiàn)逐漸消瘦、體質衰弱的現(xiàn)象，以及這些癥狀的進展情況。檢查馬匹是否出現(xiàn)貧血癥狀，如結膜蒼白等，并觀察是否有出血傾向，如鼻出血、便血等。仔細觀察馬匹是否出現(xiàn)浮腫癥狀，特別是下肢和腹部，以及浮腫的程度和變化情況。臨床表現(xiàn)觀察病原學檢測通過聚合酶鏈式反應（PCR）等技術，檢測血液或其他組織樣本中的馬傳染性貧血病毒核酸。病毒分離與鑒定嘗試從涉病馬匹的樣本中分離出馬傳染性貧血病毒，并進行鑒定，以確定病原體。血清學檢測采集涉病馬匹的血液樣本，運用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等方法檢測馬傳染性貧血病毒抗體。實驗室檢測03在綜合判定的基礎上，及時采取針對性的防控措施，控制疫情的擴散和傳播。01結合流行病學調查、臨床表現(xiàn)觀察和實驗室檢測結果，對涉病馬匹是否患有馬傳染性貧血進行綜合分析。02根據(jù)各項指標的權重和關聯(lián)性，制定科學的判定標準，以確保診斷結果的準確性和可靠性。綜合分析與判定15附錄A(規(guī)范性)試劑的配制抗原針對馬傳貧病病毒特異性抗體，用于檢測血樣中的病毒抗體。抗體對照品包括強陽性、弱陽性和陰性對照血清，用于驗證試劑的準確性和可靠性。采用我國培育的馬傳貧驢白細胞弱毒疫苗株制作，具有高特異性和敏感性。診斷試劑的組成123通過細胞培養(yǎng)、病毒擴增和純化等工藝，獲得高純度的馬傳貧病病毒抗原?？乖苽淅锰囟ǖ臉擞浖夹g對抗體進行標記，以便在檢測過程中能夠準確識別病毒抗體?？贵w標記按照一定比例稀釋和配制對照血清，確保其與實際檢測血樣具有相同的基質效應。對照品設置試劑的配制步驟嚴格篩選和檢測原料，確保其質量符合試劑配制要求。原料控制在試劑配制過程中，對各關鍵環(huán)節(jié)進行監(jiān)控和記錄，確保試劑的穩(wěn)定性和一致性。過程控制對配制完成的試劑進行全面檢驗，包括物理性狀、無菌檢查、效價測定等，確保其符合相關質量標準。成品檢驗010203試劑的質量控制保存條件試劑應在規(guī)定的溫度、濕度和光照條件下保存，避免受潮、高溫和陽光直射。使用期限試劑應在有效期內使用，過期試劑不得繼續(xù)使用，以免影響檢測結果。使用方法按照試劑說明書和操作規(guī)程進行使用，確保檢測結果的準確性和可靠性。試劑的保存與使用03020116附錄B(資料性)實時熒光PCR引物和探針定義與原理實時熒光PCR是一種結合PCR擴增與熒光檢測技術的方法，通過熒光信號實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物的生成，實現(xiàn)定量和定性分析。引物與探針的作用引物用于PCR擴增的起始，特異性識別并結合模板DNA；探針則與擴增產(chǎn)物特異性結合，產(chǎn)生熒光信號，用于檢測和分析。實時熒光PCR技術簡介特異性引物和探針應特異性識別目標DNA序列，避免非特異性擴增和信號干擾。02靈敏度設計的引物和探針應具有高靈敏度，能夠準確檢測低濃度的目標DNA。03穩(wěn)定