【生物】動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修三

第2章

細胞工程本節(jié)聚焦:什么是動物細胞融合技術(shù)？單克隆抗體是如何制備的？

在臨床上有哪些應(yīng)用？第2節(jié)

動物細胞工程(二)動物細胞融合和單克隆抗體二、植物體細胞雜交技術(shù)課前提問胰蛋

白酶

處理取動物組織分散成單個細胞細胞懸液加培養(yǎng)液

轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)離心法收集細胞并制成細胞懸液原代培養(yǎng)分裂受阻

轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)傳代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)植物體細胞雜交植物細胞融合植物組織培養(yǎng)溫故知新：植物體細胞雜交技術(shù)打破生殖隔離，克服遠緣雜交不親和障礙，培育出新的作物類型。從社會中來運用植物體細胞雜交技術(shù)，可培育新的作物類型

那么，能不能讓不同種動物的體細胞進行雜交，培育出集不同細胞優(yōu)勢于一身的動物細胞呢？實例：1970年，人—鼠細胞熒光標(biāo)記融合實驗人細胞鼠細胞紅色熒光染料標(biāo)記的膜蛋白綠色熒光染料標(biāo)記的膜蛋白細胞融合人鼠雜交細胞37°培養(yǎng)40min細胞融合實驗表明：細胞膜具有流動性有沒有技術(shù)能讓不同種動物的體細胞雜交？思考：動物細胞進行融合，與植物有哪些不同之處？無需去除細胞壁；全能性受限制，不能培育成新的動物個體。顯微鏡下的動物細胞融合動物細胞融合概念原理誘導(dǎo)方法使兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的技術(shù)。細胞膜具有一定的流動性物理法：電融合法化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活病毒誘導(dǎo)法一、動物細胞融合技術(shù)——動物細胞融合特有的誘導(dǎo)方法滅

活

病

毒思考：滅活病毒誘導(dǎo)細胞融合的原理是什么呢？滅活：是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞相互凝集，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。動物細胞融合完成的標(biāo)志動物細胞融合結(jié)果意義運用形成具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息的雜交細胞突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能。第一第二第三為制造單克隆抗體開辟了新途徑。研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。至今，種間、屬間、科間，甚至動物和植物之間的細胞融合都已獲得成功。一、動物細胞融合技術(shù)植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細胞融合的方法細胞融合成功的標(biāo)志主要用途意義細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞再生出細胞壁細胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能植物體細胞雜交和動物細胞融合比較①物理法：電融合法。②化學(xué)法：PEG融合法。③生物法：滅活病毒誘導(dǎo)法①物理法：電融合法、離心法等。②化學(xué)法：PEG融合法、

高Ca2＋—高pH融合法等(1)與植物原生質(zhì)體融合相比，動物細胞融合特有的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇(PEG)、滅活的病毒(

)(2)滅活的含義是用物理或化學(xué)手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)(

)(3)二倍體動物細胞融合后的雜交細胞仍然是二倍體細胞(

)×√判斷下列正誤×1．下圖表示用仙臺病毒誘導(dǎo)動物細胞融合的部分過程，下列相關(guān)敘述正確的是(

)A．細胞A和細胞B必須為同種細胞才能融合B．細胞C同時有細胞A和細胞B的遺傳物質(zhì)C．該融合過程體現(xiàn)了細胞膜具有選擇透過性D．植物細胞的融合過程與動物細胞完全相同B2．如圖為動物細胞融合技術(shù)過程圖，下列相關(guān)敘述錯誤的是(

)A．圖中①過程發(fā)生了細胞膜的融合，

體現(xiàn)了細胞膜的選擇透過性B．圖中C為滅活病毒，此外還可用

物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)動物細胞融合C．圖中②過程表示細胞核融合形成雜種細胞D．動物細胞融合技術(shù)可用于制備單克隆抗體A這個場景大家再熟悉不過了出外做核酸太麻煩，在家如何確定自己是否“陽”了？單克隆抗體血清（抗體主要分布部位）傳統(tǒng)抗體制備方法:向動物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，使動物產(chǎn)生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體。缺陷：產(chǎn)量低、純度低，特異性差血清含量有限(一)傳統(tǒng)抗體制作方法及缺陷：二、單克隆抗體及其應(yīng)用二、單克隆抗體及其應(yīng)用病原體處理呈遞輔助性T細胞結(jié)合記憶B細胞漿細胞抗體第一信號分裂、分化

并分泌細胞因子分裂分化促進產(chǎn)生分泌第二信號B細胞抗原呈遞細胞結(jié)合抗體與病原體結(jié)合后形成沉淀等，進而被其他免疫細胞吞噬消化。攝取知識回顧：抗體的產(chǎn)生抗體1抗體2抗體3抗體4…….動物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體的種類超過百萬種抗原1抗原2抗原3抗原4B細胞1B細胞2B細胞3B細胞4…….每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體刺激刺激刺激刺激(一)傳統(tǒng)抗體制作方法及缺陷：二、單克隆抗體及其應(yīng)用問題:若我們只需要大量的抗體4有什么辦法嗎？若能得到大量的B細胞4就可以需要得到遺憾：如何解決這一難題？B淋巴細胞不能無限增殖（１）動物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類多達百萬種；（２）每個B淋巴細胞（漿細胞）只分泌一種特異性的抗體?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)：遺憾：如何解決這一難題？二、單克隆抗體及其應(yīng)用如何獲得大量、單一的抗體？每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體單一B淋巴細胞細胞群選擇克隆產(chǎn)生大量純度高特異性強的抗體B淋巴細胞不可能無限增殖一個極富創(chuàng)造力的方案：動物細胞融合雜交細胞動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體骨髓瘤細胞（癌細胞）

(能無限增殖)

一種B淋巴細胞(只分泌一種特異性抗體)雜交瘤細胞：既能無線增殖增殖，又能產(chǎn)生專一抗體1975年，米爾斯坦和柯勒二、單克隆抗體及其應(yīng)用1984年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎由單一雜交瘤細胞增殖產(chǎn)生的特異性抗體。注：B淋巴細胞指的是活化的B淋巴細胞（指從成熟的B細胞向漿細胞分化的時期），其融合的效率最高；若直接用漿細胞，融合效率很低。單克隆抗體：由單一雜交瘤細胞增殖產(chǎn)生的特異性抗體。如何得到能產(chǎn)生抗體且增殖能力強的細胞？思考與討論單克隆抗體分析概念中“單”和“克隆”的含義?？偨Y(jié)單克隆抗體的概念？注：B淋巴細胞指的是活化的B淋巴細胞（指從成熟的B細胞向漿細胞分化的時期），其融合的效率最高，若直接用漿細胞，融合效率很低。二、單克隆抗體及其應(yīng)用1.制備單克隆抗體的原理（1）每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，在體外培養(yǎng)條件下，不能無限增殖。（2）骨髓瘤細胞能無限增殖，不能產(chǎn)生抗體。（3）通過動物細胞融合技術(shù)將兩種細胞融合，得到的融合細胞既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體。骨髓瘤細胞能無限增殖能產(chǎn)生抗體B淋巴細胞單克隆抗體的制備過程從患骨髓瘤的小鼠體內(nèi)取骨髓瘤細胞進行培養(yǎng)多種已免疫B淋巴細胞骨髓瘤細胞誘導(dǎo)融合小鼠的脾臟中獲取注射特定的抗原,小鼠脾產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞2.單克隆抗體的制備過程：B細胞1B細胞2B細胞3B細胞4B細胞2B細胞3B細胞4骨髓瘤細胞B細胞1雜交1雜交2雜交3雜交402雜交瘤細胞（多種）置于選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)第一次

篩選融合的細胞B細胞自身融合未融合的B淋巴細胞B瘤骨髓瘤細胞自身融合未融合的骨髓瘤細胞2.單克隆抗體的制備過程B瘤B瘤第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。【第一次篩選】獲得雜交瘤細胞①細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。②B淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細胞中只有D途徑，沒有S途徑，但能不斷分裂增殖。篩選出雜交瘤細胞方法？培養(yǎng)基中加入氨基嘌呤（HAT選擇培養(yǎng)基）B，B-B：不能無限增殖，死亡瘤，瘤-瘤：不能無限增殖，死亡雜交瘤細胞：（B-瘤）能無限增殖，生長D途徑、S途徑D途徑D途徑、S途徑02雜交瘤細胞（多種）置于選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)第一次篩選融合的細胞B細胞自身融合未融合的B淋巴細胞B瘤骨髓瘤細胞自身融合未融合的骨髓瘤細胞2.單克隆抗體的制備過程B瘤B瘤第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。第二次篩選第二次篩選：得到能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞

克隆化培養(yǎng)2.單克隆抗體的制備過程96孔板第二次篩選：得到能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞

克隆化培養(yǎng)2.單克隆抗體的制備過程抗原4第二次篩選：得到能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞

抗體檢測2.單克隆抗體的制備過程抗體檢測呈陽性第二次篩選：得到能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞

抗體檢測2.單克隆抗體的制備過程原理：抗原-抗體雜交第二次篩選獲得產(chǎn)生專一抗體的雜交瘤細胞使用96孔板培養(yǎng)和篩選雜交瘤細胞，每一個孔盡量只接種一個雜交瘤細胞，即將單個雜交瘤細胞單獨培養(yǎng)，通過克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，即可獲得大量能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞體外培養(yǎng)單克隆抗體體內(nèi)

或

體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔2.單克隆抗體的制備過程優(yōu)點：易于控制培養(yǎng)條件，操作簡單，成本較低。缺點：規(guī)模小，產(chǎn)量少小鼠腹水

或

培養(yǎng)液提取優(yōu)點：可大規(guī)模培養(yǎng)，產(chǎn)量大。缺點：需要認為控制培養(yǎng)條件，成本高

體外培養(yǎng)

或

小鼠腹腔內(nèi)增殖（培養(yǎng)液提?。ㄐ∈蟾顾崛。﹩慰寺】贵w未融合和多種雜交細胞多種雜交瘤細胞第一次篩選骨髓瘤細胞分泌特異抗體的雜交瘤細胞多種B淋巴細胞動物細胞融合技術(shù)動物細胞培養(yǎng)技術(shù)特異性強靈敏度高可大量制備給小鼠注射特定的抗原單克隆抗體的制備過程選擇性培養(yǎng)基第二次篩選原理：抗原-抗體雜交既能大量繁殖又能產(chǎn)生專一抗體

誘導(dǎo)融合

電融合法、PEG、滅活病毒原理：細胞膜的流動性原理：細胞增殖克隆化培養(yǎng)和抗體檢測1．用特定的抗原對小鼠進行免疫后，從小鼠脾臟中只能得到一種B淋巴細胞。()2．單克隆抗體制備過程中的兩次篩選目的相同。(

)3．制備單克隆抗體時可從未經(jīng)免疫的小鼠體內(nèi)提取B淋巴細胞。()4．經(jīng)特定抗原免疫過的B淋巴細胞在體外培養(yǎng)時可分泌單克隆抗體。()練習(xí)與應(yīng)用提示：從免疫后的小鼠脾臟中獲取的是多種B淋巴細胞。提示：第一次篩選的目的是獲得雜交瘤細胞，而第二次篩選的目的是獲得能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。提示：制備單克隆抗體時，首先將抗原注入小鼠體內(nèi)，獲得能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞。提示：經(jīng)特定抗原免疫過的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞雜交融合后，篩選出能產(chǎn)生單一抗體的雜交瘤細胞，然后再進行體外培養(yǎng)或注入小鼠腹腔培養(yǎng)獲得單克隆抗體?！痢痢痢?．下列關(guān)于單克隆抗體制備的說法，正確的是(

)A．將特定抗原注射到小鼠體內(nèi)，可以從小鼠血清中獲得單克隆抗體B．經(jīng)特定抗原免疫過的B淋巴細胞在體外培養(yǎng)時可分泌單克隆抗體C．誘導(dǎo)B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合后，發(fā)生融合的細胞均為雜交瘤細胞D．篩選出雜交瘤細胞后，需利用特定抗原再次篩選分泌單克隆抗體的細胞D1．圖中B淋巴細胞、骨髓瘤細胞和A細胞各有何特點？3．過程1中誘導(dǎo)細胞融合措施是什么？B淋巴細胞：能產(chǎn)生單一抗體，但不能無限增殖。骨髓瘤細胞：能無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。A細胞(雜交瘤細胞)：既能產(chǎn)生抗體，又能無限增殖。2．制備單克隆抗體時，給小鼠注射特定抗原后，小鼠體內(nèi)發(fā)生了什么生理過程？

小鼠產(chǎn)生了體液免疫，生成能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞。PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法等單克隆抗體制備流程歸納：誘導(dǎo)融合選擇培養(yǎng)基抗原-抗體雜交體外培養(yǎng)

或小鼠腹腔內(nèi)增殖多種B淋巴細胞骨髓瘤細胞未融合細胞和多種雜交細胞多種雜交瘤細胞單克隆抗體能分泌所需抗體的雜交瘤細胞第一次篩選第二次篩選注射特定的抗原習(xí)題中有時會合并這兩步驟（筆記）單克隆抗體的制備小結(jié)（1）該過程中應(yīng)用到的技術(shù)_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的______________________________________________（4）誘導(dǎo)融合的方法______________________________________動物細胞特有的誘導(dǎo)融合方法為_______________________動物細胞融合、動物細胞培養(yǎng)細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖用特定的抗原對小鼠進行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法滅活病毒誘導(dǎo)法（5）第一次篩選的目的______________________

第一次如何篩選___________________________

篩選原理_________________________________________________________________________________篩選獲得雜交瘤細胞用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選在選擇培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長單克隆抗體的制備小結(jié)（6）雜交瘤細胞的特點__________________________________（7）第二次篩選的目的________________________________________________如何篩選___________________________________________________選擇抗體檢測呈___性的雜交瘤細胞，即_____________

_____________（8）抗體檢測原理_______________________________________獲得能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測（進行多次篩選）分泌的抗體能與特定的抗原結(jié)合抗原和抗體能夠特異性結(jié)合(分子水平的鑒定）既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體（9）如何獲取大量所需雜交瘤細胞__________________________________________（10）如何獲取單克隆抗體①體外培養(yǎng)___________________________②小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)_________________________（11）單克隆抗體的優(yōu)點___________________________________________在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)（接種于培養(yǎng)液中）或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖從細胞培養(yǎng)液中獲取從小鼠腹水中獲取特異性強，靈敏度高，可大量制備陽【資料1】用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在90%以上。具有準確、高效、簡易、快速特點診斷優(yōu)點：3.單克隆抗體的應(yīng)用作為診斷試劑——最廣泛的應(yīng)用抗體藥物接頭ADC被細胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細胞凋亡抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細胞毒素)三部分組成3.單克隆抗體的應(yīng)用用于治療疾病和運載藥物生物導(dǎo)彈=單克隆抗體+藥物。單克隆抗體：起導(dǎo)向作用，能特異性識別腫瘤抗原藥物：發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細胞。討論1：ADC的抗體和藥物各具有什么作用？抗體：導(dǎo)向作用。即通過特異性結(jié)合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；藥物：發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細胞。3.單克隆抗體的應(yīng)用討論2：除了細胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？①

可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進行靶向放療；②

一些作用于細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進行治療。討論3：單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢？①

單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準化生產(chǎn)診斷試劑盒；②

ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優(yōu)點。抗體藥物接頭ADC被細胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細胞凋亡歸納：單克隆抗體的應(yīng)用（1）廣泛用作診斷試劑利用同位素或熒光標(biāo)記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。（2）運載藥物：如抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）。生物導(dǎo)彈=單克隆抗體+藥物，治療腫瘤。(單抗：起導(dǎo)向作用)優(yōu)點：位置準確、療效高、副作用小（3）直接用于