魚類種質(zhì)檢驗 第13部分：同工酶電泳分析 規(guī)范要求

1魚類種質(zhì)檢驗4.1丙烯酰胺（Arc）。4.2N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺或甲叉雙丙烯酰胺（Bis）。4.3四甲基乙二胺（TEMED）。4.4過硫酸胺。4.5三羥甲基氨基甲烷（Tris）。4.6檸檬酸。4.7乙二胺四乙酸（EDTA）。4.8硼酸。4.9L-組氨酸。24.10乳酸或乳酸鈉。4.11DL-蘋果酸。4.12α-磷酸甘油鈉。4.13磷酸氫二鈉（Na2HPO4）。4.14二個結晶水的磷酸二氫鈉（NaH2PO4?2H2O）。4.15輔酶Ⅰ（NAD）。4.16輔酶Ⅱ（NADP）。4.17吩嗪甲酯硫酸鹽（PMS）。4.18氯化硝基四氮唑藍（NBT）。4.19山梨醇。4.20DL-異檸檬酸三鈉。4.216-磷酸葡萄糖酸鈉。4.24丙酮。4.26氨基黑10B。4.29氫氧化鈉（NaOH）。4.30固定液：3份乙醇，加1份冰醋酸，加1份甘油，加5份蒸餾水，混合均勻。4.32EBT制膠緩沖液：三羥甲基氨基甲烷5.4513g，EDTA0.2922g，用硼酸調(diào)節(jié)至pH8.6，蒸餾水定容至1L。4.33HC制膠緩沖液：組氨酸1.9395g，檸檬酸21.014g，用5%NaOH調(diào)至pH8.2，蒸餾水定容4.34TC電極緩沖液：三羥甲基氨基甲烷4.865g，用檸檬酸調(diào)pH至8.0，蒸餾水稀釋至1L。4.35EBT電極制膠緩沖液：三羥甲基氨基甲烷65.4g，EDTA3.51g，用硼酸調(diào)至pH8.6，蒸餾水稀釋至15L。34.36HC電極制膠緩沖液：組氨酸1.9395g，檸檬酸21.014g，用5%NaOH調(diào)pH至8.5，蒸餾水4.3825%TEMED：TEMED25mL，加入75mL蒸餾水。4.39100mg/mL過硫酸胺：過硫酸胺0.1g，溶解于1mL蒸餾水中。4.404%聚丙烯酰胺凝膠：Arc.Bis液13.2mL，制膠緩沖液14.7mL，蒸餾水37.5mL，25%TEMED5儀器與設備5.1微量勻漿機，轉(zhuǎn)速4000r/min?；虿Ａ驖{器。5.2高速冷凍離心機，轉(zhuǎn)速12000r/min，冷凍溫度為4℃。5.4激光掃描儀。5.6微量加樣注射器。5.7制膠模具。5.8染色缸。5.9低溫冰箱，冰室溫度在-30℃以下。5.10恒溫培養(yǎng)箱。5.11分析天平，感量為0.0001g。5.12電子天平，感量為0.1g。4活體解剖樣品魚，取1g～2g組織試樣，放入編號的小塑料袋中；對于血液試樣用注射器從魚的尾動（靜）脈抽血，分離出血清。樣品均需置于低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?分析步驟取0.3g左右樣品，以1份試樣加入3份體積的0.3%NAD液2min或冰浴條件下使用玻璃勻漿器勻漿，粉碎組織。用吸管將勻漿后的樣品移入指管中，在冷凍離心機中離心直至上清液澄清，以上操作均在4℃低溫下進行。制備后樣品于冰箱中暫存或直接電凝膠制備按試劑與材料中4.40的規(guī)定執(zhí)行。7.3.2預電泳：依酶的種類不同，采用相應的凝膠緩沖系統(tǒng)。并將預先制備的聚丙烯酰胺凝膠放在冷取與凝膠板大小適中的玻璃紙，浸泡濕潤后，平鋪在凝膠板上，排空氣泡，四周向下包緊。在室溫下自然風干，制成透明膠片，編號保存。5對凝膠及其譜帶進行拍照記錄，也可用激光掃描儀對電泳譜帶進行掃描，計算同工酶各組分的相對含量。6染色緩沖液輔酶INADmg輔酶IINADPmg1mg/mLNBTmLPMSmg其它試劑醇脫氫酶ADH0.25mol/LTris–HClpH8.0,140mL2295%乙醇4.5mL酯酶ESTα-乙酸萘酯20mg堅牢蘭RR100mg甘油-3-磷酸脫氫酶α-GPDH0.25mol/LTris–HCl45211mol/L甘油磷酸鈉山梨醇脫氫酶0.25mol/LTris–HClpH8.0,140mL22異檸檬酸脫氫酶IDH1.5mol/LTris–HClpH9.5,15mLMgCl2150mg蒸餾水105mL乳酸脫氫酶LDH1.5mol/LTris–HClpH9.5,15mL蒸餾水95mL蘋果酸脫氫酶MDH1.5mol/LTris–HClpH9.5,15mL蒸餾水90mL蘋果酸酶ME1.5mol/LTris–HClpH8.0,15mL40蒸餾水90m