注射劑中熱原的特征、檢測方法、污染途徑及去除方法研究

摘

要：介紹了注射劑中熱原的特征、檢測方法、污染途徑及去除方法，為制藥企業(yè)在實際生產過程中如何防止熱原污染和靈活選擇去除熱原的方法提供了參考。關鍵詞：熱原；特征；檢測方法；污染途徑；去除方法

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引言熱原系指由微生物產生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質，它包括細菌性熱原、內源性高分子熱原、內源性低分子熱原及化學熱原等。這里所指的“熱原”是指細菌性熱原（細菌內毒素），它是某些細菌的代謝產物、細菌尸體及其內毒素，即細菌性熱原是由細菌在生長、繁殖過程中產生的代謝產物以及細菌死亡后從細菌尸體中釋放出的內毒素等混合而成，主要成分是由磷脂多醇與蛋白質結合而成的復合物，其中的磷脂多醇是復合物的活性中心，致熱作用最強，其化學組成因菌種不同而有所差異，分子量為5×104～5×105，分子量越大，致熱作用越強。當細菌存在于藥液中，并具備細菌生長繁殖的條件時，如有水分、溫度與酸堿度適宜細菌生長、有足夠的營養(yǎng)物質，細菌就會快速生長繁殖，就有可能產生熱原。大多數(shù)細菌和霉菌都能產生熱原，致熱能力最強的是革蘭氏陰性桿菌的產物，其次是革蘭氏陽性桿菌類，革蘭氏陽性球菌則較弱，此外，霉菌、酵母菌甚至病毒也能產生熱原。當注入人體的注射劑中含有的熱原量達1μg/kg時，就可引起不良反應，發(fā)熱反應通常在注入1h后出現(xiàn)，可使人體產生發(fā)冷、寒顫、發(fā)熱、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時體溫可升至40℃以上，嚴重者甚至昏迷、虛脫，如不及時搶救，可危及生命。鑒于注射劑中的熱原對人體的危害極大，本文將對熱原的特征、檢測方法、污染途徑和去除方法進行研究總結。

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注射劑中熱原的特征1.1

水溶性熱原能溶于水，其濃縮液往往有乳光。1.2

耐熱性熱原在60℃干熱1h條件下不受影響，100℃時也不會分解，在120℃干熱4h條件下能被破壞98%左右，在180～200℃干熱180min、250℃干熱30min、350℃干熱5min、650℃干熱1min條件下則可被徹底破壞。而通常采用的注射劑濕熱滅菌條件，不能破壞熱原。1.3

濾過性熱原體積小（長度1～5nm），能通過一般的除菌過濾器，不能被截留除去，但用小于1nm孔徑的微孔濾膜或超過濾器濾過，則可濾去絕大部分甚至全部熱原。1.4

不揮發(fā)性熱原本身不揮發(fā)，溶于水，但可隨水蒸氣的霧滴夾帶入蒸餾水中，故蒸餾水器均設隔膜裝置。1.5

可吸附性熱原能被活性炭、白陶土、硅藻土等吸附，但屬非特異性吸附，藥物也會被吸附造成損失。此外，熱原還可被離子交換樹脂，尤其是陰離子交換樹脂所交換而除去。1.6

可破壞性熱原可被強堿、強酸、氧化劑等破壞，故可用強堿或強酸、清潔液來處理帶熱原的容器具。

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注射劑中熱原的檢測方法2.1

家兔法由于家兔對熱原的反應與人基本相似，因此，家兔法是各國藥典規(guī)定的檢查熱原的法定方法。2015版《中國藥典》規(guī)定的熱原檢查法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規(guī)定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。家兔法檢查結果的準確性和一致性取決于試驗動物的狀況、試驗室條件和操作的規(guī)范性。家兔法檢測內毒素的靈敏度為0.001μg/mL，試驗結果接近人體真實情況，但操作繁瑣、費時，不能用于注射劑生產過程中的質量監(jiān)控，且不適用于放射性藥物、腫瘤抑制劑等細胞毒性藥物制劑的熱原檢測。2.2

細菌內毒素檢查法（鱟試劑法）細菌內毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細菌內毒素的量用內毒素單位（EU）表示。細菌內毒素檢查方法包括凝膠法和光度測定法兩種，前者利用鱟試劑與細菌內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素，后者包括濁度法和顯色基質法，系分別利用鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化及產生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少來測定內毒素。鱟試劑法檢查內毒素的靈敏度為0.0001μg/mL，比家兔法靈敏10倍，操作簡單易行，試驗費用低，結果迅速可靠，適用于注射劑生產過程中的熱原控制以及家兔法不能檢測的某些細胞毒性藥物制劑的檢測，但其對革蘭氏陰性菌以外的內毒素檢測不靈敏，鱟試劑法尚不能完全代替家兔法。鱟試劑法中使用的鱟試劑是由海洋生物鱟的血液變形細胞溶解物制成的無菌冷凍干燥品，含有能被微量細菌內毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原、凝固蛋白原，是從棲生于海洋的節(jié)肢動物“鱟”的藍色血液中提取變形細胞溶解物，經低溫冷凍干燥而成的生物試劑，能夠準確、快速地定性或定量檢測樣品中是否含有細菌內毒素和（1，3）-β-葡聚糖。鱟試劑法是國際上至今為止檢測內毒素最好的方法，它簡單、快速、靈敏、準確，因而被歐美藥典及我國藥典定為法定的內毒素檢查法，并已被世界各國所采用。3

注射劑中熱原的污染途徑3.1

生產過程中操作人員帶入在注射劑的生產過程中，操作人員如果不按要求進行著裝和操作，就有可能污染經過處理的生產環(huán)境、生產設備及附屬系統(tǒng)和藥液，進而把熱原帶入注射劑中。3.2

生產過程中生產設備及附屬系統(tǒng)帶入在生產注射劑時，生產注射劑的設備、管道、過濾器、容器、用具等，使用前未徹底清洗、滅菌和除盡熱原，均有可能污染注射劑。3.3

原輔料帶入某些原輔料，如中藥提取物、蔗糖、含蛋白為主的生物制品等，由于細菌容易繁殖而引起熱原污染。原輔料被熱原污染的原因有很多，如包裝不符合要求、包裝出現(xiàn)破損或貯存時間長久，以及許多藥品本身適于微生物生長，所以在選用原輔料時應多加注意。3.4

由溶劑帶入注射用水含熱原是注射劑中熱原的主要污染途徑。由于蒸餾器結構不合理、操作不當、容器不潔凈、放置時間過久等都會引起熱原污染。在注射劑的配制過程中，溶劑最好是新鮮制備的，如注射用水貯藏時間過久，被細菌污染后，細菌很快繁殖，短時間內可產生大量熱原，雖然隨后還會進行滅菌操作，但是已有熱原存在，不易除去，因而易產生熱原反應。因此，配制注射劑時應使用新鮮注射用水，最好隨制隨用，2010版GMP規(guī)定注射用水可采用70℃以上保溫循環(huán)的方式存放。3.5

由生產工藝帶入如果生產工藝中制定的去除熱原的參數(shù)，如溫度、時間、酸堿濃度、膜孔徑等制定不正確，將無法徹底除去生產設備及附屬系統(tǒng)、接觸藥液的內包裝材料和藥液半成品中的熱原，進而造成注射劑受熱原污染。3.6

生產過程中的環(huán)境帶入注射劑的整個生產過程要求在規(guī)定的潔凈環(huán)境中進行，盡可能減少微生物污染的風險。注射劑的潔凈生產環(huán)境按2010版GMP的規(guī)定，一般分為A級、B級、C級、D級，如果生產環(huán)境不符合GMP要求，就會增加微生物污染的風險。3.7

臨床應用前帶入注射劑成品在保存及運輸過程中，由于操作不當，造成注射劑的內包裝損壞，污染注射劑進而產生熱原。3.8

從輸液器中帶入有時注射劑本身雖不含熱原，但注射后卻有熱原反應，這很可能是由于輸液用具受污染產生熱原，輸液用具包括一次性輸液器、一次性輸液管等。3.9

在注射過程中帶入（1）在輸液過程中加入其他藥物時，所加藥物本身已被污染，產生熱原；（2）加藥時操作室的潔凈度差，環(huán)境不符合要求，消毒及注射操作方法違規(guī)；（3）加藥后放置時間長，增加了污染的風險。

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注射劑中熱原的去除方法4.1

利用熱原的水溶性去除熱原4.1.1

密閉的生產設備系統(tǒng)采用在線清洗/滅菌的方法，用新鮮注射用水在線清洗15min、121℃在線滅菌15min的方法建立無熱原、無菌的密閉的生產設備系統(tǒng)。4.1.2

生產用容器具不能在線清洗/滅菌的生產用容器具，可用新鮮注射用水清洗15min、濕熱滅菌柜121℃滅菌15min或者115℃滅菌30min的方法，確保容器具無熱原、無菌。利用在線沖洗和在線滅菌相結合的方式去除熱原，雖然操作方便，但是會浪費大量的注射用水。4.2

利用熱原不耐干熱的特性去除熱原對耐受高溫處理的制藥用生產用容器具，可采用180～200℃干熱180min、250℃干熱30min、350℃干熱5min的方法清除生產用容器具的熱原。4.3

利用熱原體積小的特性去除熱原采用小于1nm孔徑的微孔濾膜或超過濾器過濾藥液，可除去液體內的熱原。4.4

利用熱原的可吸附性[3]去除熱原通常藥液里的熱原可選用優(yōu)質活性炭（針劑用）、白陶土、硅藻土進行吸附。但是，使用活性炭吸附熱原時需要注意以下事項：（1）活性炭的臨界吸附溫度為45～50℃，當溫度低于臨界吸附溫度時，活性炭的吸附效力較差，除需冷藏和不便加熱的藥液外，使用時一般藥液經加熱煮沸后吸附15～30min，再冷卻至45～5O℃過濾脫炭，脫炭最好在短時間內完成，以免溫度下降或在放置過程中發(fā)生脫吸附作用，使制劑雜質增多。（2）活性炭的用量應視原料質量、品種而定，常用量為0.1%～0.5%（W/V）。若用量不足，對雜質、熱原等不能完全吸附；若用量過大，其所含的水溶性雜質可對藥液造成污染，影響制劑質量。活性炭的用量與活性炭的吸附力、活性炭對藥物的吸附力、溶媒的性質、藥物的結構等因素都有關系?；钚蕴吭谒斜仍谟袡C溶媒中的吸附力強；對極性基團多的化合物的吸附力大于對極性基團少的化合物；對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；對分子量大的化合物吸附力大于分子量小的化合物。因此，對主藥含量低或主藥易被活性炭吸附的制劑，活性炭的用量最好控制在0.05%（W/V），并通過計算適當增加主藥投料量。4.5

利用熱原大分子上含磷酸根與羧酸根的特性去除熱原熱原這類大分子上含磷酸根與羧酸根，往往帶有負電荷，故易被強堿性陰離子交換樹脂所交換，可采用離子交換法除去藥液中的熱原。4.6

利用熱原可被強堿、強酸、氧化劑等破壞的特性去除熱原可使用強堿或強酸來處理帶熱原的制藥用生產設備及附屬系統(tǒng)、容器具，具體方法是使用低濃度的強堿（如1%的氫氧化鈉溶液）或強酸對配液罐及其管道、容器具浸泡8h，用高濃度的強堿（如10%的氫氧化鈉溶液）或強酸對配液罐及其管道、容器具進行擦拭，存放8h，就可以除去生產設備及附屬系統(tǒng)、容器具上的熱原。這種去除方法的缺點是浪費時間，優(yōu)點是能夠節(jié)省大量的注射用水。4.7

利用凝膠過濾法去除熱原凝膠可作為分子篩，利用熱原與藥物分子量的差異，將兩者分開。但當兩者分子量相差不大時，不宜使用該方法。4