薄層色譜法在強力腦心康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法中的應(yīng)用研究

摘

要：為完善強力腦心康膠囊質(zhì)量檢驗標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》四部通則《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則》要求，采用薄層色譜法，對強力腦心康膠囊的主要成分——蜜環(huán)菌提取物中的多糖和肽進(jìn)行鑒別分析實驗，實驗結(jié)果表明，薄層色譜法專屬性高，重現(xiàn)性、耐用性好。關(guān)鍵詞：薄層色譜法；強力腦心康膠囊；蜜環(huán)菌提取物；多糖

0

引言薄層色譜法（TLC），是指將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，使其呈一均勻薄層，待點樣、展開后，根據(jù)比移值（Rf）與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對比，用以進(jìn)行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定的方法。薄層色譜法是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實驗技術(shù)，也常用于跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。依據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》四部通則《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則》要求，利用薄層色譜法，對強力腦心康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中所增加的蜜環(huán)菌提取物多糖與肽的檢測項進(jìn)行分析方法的研究，以完善該產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗標(biāo)準(zhǔn)，確保該產(chǎn)品質(zhì)量滿足患者需求。

1

實驗設(shè)備、儀器與試劑1.1

實驗設(shè)備與儀器DHG202型電熱干燥箱、WS2-133-85-2型電熱恒溫水浴鍋、202-0型臺式干燥箱、HHB11-42型電熱恒溫培養(yǎng)箱；DT-100型帶光分析天平、TG-328A電光分析天平、AG135型電子天平、JD-200多功能電子天平；SK3200HP型超聲波清洗器、DS10260超聲波清洗器；UV-1型三用紫外分析儀；QY-20三用紫外分析儀；XS-810生物顯微鏡；ZH-2自動漩渦混合器、YXQ、SG46.280手提式煤電兩用消毒器。1.2

試劑石油醚、醋酸乙酯、苯、磷鉬酸；香草醛。

2

藥材標(biāo)準(zhǔn)2.1

丹參本品為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖。春、秋兩季采挖，除去泥沙，干燥。本品應(yīng)符合2015版《中華人民共和國藥典》一部“丹參”項下的有關(guān)規(guī)定，并以此作為鑒定依據(jù)。2.2

蜜環(huán)菌（提取物）本品為白蘑科真菌蜜環(huán)菌Armillariamellea（vane.ex.Fr.）Quel.經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，分離提取制得的干燥菌粉。本品所含多糖以無水葡萄糖（C6H12O6）計，不得低于5.0%，所含肽不得低于5.0%。本品應(yīng)符合國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)）WS-10001-（HD-1224）-2002“蜜環(huán)菌”項下的有關(guān)規(guī)定，并以此作為鑒定依據(jù)。2.3

蜂王漿（凍干粉）本品為工蜂咽下腺和上腭腺分泌的，主要用于飼喂蜂王和蜂幼蟲的乳白色、淡黃色或淺橙色漿狀物質(zhì)。本品應(yīng)符合《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)》GB9697—2008“蜂王漿Royaljelly”和《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)》GB21532—2008“蜂王漿凍干粉Lyophilizedroyaljellypowder”項下的有關(guān)規(guī)定，并以此作為鑒定依據(jù)。

3

強力腦心康膠囊的制備取丹參75g，粉碎成細(xì)粉；剩余丹參粉碎成粗粉，加水煎煮三次，第一、二次各煎煮2h，第三次煎煮3h，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.30～1.32（70℃）的稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉；蜜環(huán)菌提取液減壓濃縮至相對密度為1.30～1.32（70℃）的稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，與上述細(xì)粉混勻，制成顆粒，干燥；蜂王漿冷凍干燥成細(xì)粉后，與上述顆?；靹颍b入膠囊，制成1000粒，即得。

4

方法與結(jié)果4.1

蜜環(huán)菌提取物中多糖的鑒別4.1.1

材料（1）對照溶液（蜜環(huán)菌提取物）；（2）空白溶液（石油醚）；（3）陰性樣品（以蜜環(huán)菌提取物為空白制得的樣品）；（4）成品：樣品1（20170401）、樣品2（20170402）、樣品3（20170403）；（5）硅膠G薄層板，分別為自制、廠牌1、廠牌2。4.1.2

樣品制備4.1.2.1

對照溶液取蜜環(huán)菌提取物1g，加石油醚（60～90℃）10mL，時時振搖，浸漬1h，濾過，濾液濃縮至約1mL，作為對照溶液。4.1.2.2

空白溶液取石油醚（60～90℃）溶液為空白溶液。4.1.2.3

陰性樣品溶液取陰性樣品1.5g，加石油醚（60～90℃）10mL，時時振搖，浸漬1h，濾過，濾液濃縮至約1mL，作為陰性樣品溶液。4.1.2.4

成品樣品溶液取3個批號的成品樣品顆粒適量，研細(xì)，分別精密稱取1.5g，加石油醚（60～90℃）10mL，時時振搖，浸漬1h，濾過，濾液濃縮至約1mL，作為成品樣品溶液。4.1.3

結(jié)果判定4.1.3.1

對照溶液按照2015版《中華人民共和國藥典》四部薄層色譜法試驗規(guī)定，吸取上述對照溶液5μL，點樣于羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（9:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，在110℃、10min條件下，立即檢視，應(yīng)有紫色斑點。4.1.3.2

空白溶液在與對照溶液色譜相應(yīng)的位置上，無斑點呈現(xiàn)。4.1.3.3

陰性樣品溶液在與對照溶液色譜相應(yīng)的位置上，無斑點呈現(xiàn)。4.1.3.4

3批成品樣品溶液在與對照溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫色斑點。4.1.4

分析方法研究4.1.4.1

專屬性4.1.4.1.1

定義當(dāng)存在其他成分，如雜質(zhì)、降解物、添加物（緩沖液、賦形劑、穩(wěn)定劑）等時，采用的分析方法能正確測定出被測成分的特性。不含被測成分的供試品均不得干擾檢測。在本試驗中，采用對照溶液、空白溶液、陰性樣品溶液、成品樣品溶液，在同一硅膠G薄層板上做斑點顏色對比，其他成分的存在應(yīng)對其檢測結(jié)果無干擾。4.1.4.1.2

具體方案取“4.1.2樣品制備”的各樣品溶液各5μL，點樣于羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（9:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，在110℃、10min條件下，立即檢視。4.1.4.1.3

判定標(biāo)準(zhǔn)成品樣品溶液色譜中，在與對照溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點；空白溶液與陰性樣品溶液色譜中，在與對照溶液色譜相應(yīng)的位置上，則無上述斑點呈現(xiàn)。4.1.4.2

重復(fù)性4.1.4.2.1

定義分析方法的重復(fù)性是指在同樣的操作條件下，檢測結(jié)果在較短時間間隔的精密度。本試驗中的重復(fù)性是對不同批號的樣品進(jìn)行連續(xù)多次測定，比較測定結(jié)果的精密度。4.1.4.2.2

具體方案取“4.1.2樣品制備”的對照溶液、3批成品樣品溶液各5μL，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（9:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，在110℃、10min條件下，立即檢視，應(yīng)有相同斑點。以此法，對3批強力腦心康膠囊樣品連續(xù)重復(fù)測定3次，比較3次結(jié)果，考察該檢測方法的重復(fù)性。4.1.4.2.3

判定標(biāo)準(zhǔn)對3個批號的強力腦心康膠囊樣品連續(xù)重復(fù)測定3次，測定結(jié)果應(yīng)一致，無明顯差異。4.1.4.3

耐用性4.1.4.3.1

定義在測定條件有較小變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為該檢測方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。本實驗中的耐用性是對不同廠家的硅膠G薄層板進(jìn)行連續(xù)多次測定，比較測定結(jié)果的耐用性。4.1.4.3.2

具體方案取“4.1.2樣品制備”的對照溶液、3批成品樣品溶液各5μL，分別點樣于同一個不同廠牌的羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（9:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，在110℃、10min條件下，立即檢視，比較3個廠牌的結(jié)果，考察該檢測方法的耐用性。4.1.4.3.3

判定標(biāo)準(zhǔn)對3個批號的強力腦心康膠囊樣品，采用3個廠牌的硅膠G薄層板重復(fù)測定3次，測定結(jié)果應(yīng)一致，無明顯差異。4.1.5

結(jié)果4.1.5.1

專屬性實驗在本試驗中，采用對照溶液、空白溶液、陰性樣品溶液、成品樣品溶液，在同一硅膠G薄層板上做斑點顏色對比，其他成分的存在對其檢測結(jié)果無干擾，空白樣品與陰性樣品沒有相同斑點呈現(xiàn)，其專屬性較高。4.1.5.2

重復(fù)性實驗對3批強力腦心康膠囊樣品連續(xù)重復(fù)測定3次，比較3次測定的結(jié)果。結(jié)果表明，3次測定結(jié)果一致，無明顯差異。4.1.5.3

耐用性實驗對3批強力腦心康膠囊樣品，采用3個廠牌的硅膠G薄層板連續(xù)重復(fù)測定3次，比較3次測定的結(jié)果。結(jié)果表明，采用3個廠牌的硅膠G薄層板的測定結(jié)果無明顯差異。4.2

蜜環(huán)菌提取物中肽的鑒別4.2.1

材料（1）對照溶液（蜜環(huán)菌提取物）；（2）空白溶液（甲醇）；（3）陰性樣品（以蜜環(huán)菌提取物為空白制得的樣品）；（4）成品：樣品1（20170401）、樣品2（20170402）、樣品3（20170403）；（5）硅膠G薄層板，分別為自制、廠牌1、廠牌2。4.2.2

樣品制備4.2.2.1

對照溶液取蜜環(huán)菌提取物1g，加甲醇10mL，時時振搖，浸漬1h，濾過，濾液濃縮至約1mL，作為對照溶液。4.2.2.2

空白溶液取甲醇溶液為空白溶液。4.2.2.3

陰性樣品溶液取陰性樣品1.5g，加甲醇10mL，時時振搖，浸漬1h，濾過，濾液濃縮至約1mL，作為陰性樣品溶液。4.2.2.4

成品樣品溶液取3個批號的成品樣品顆粒適量，研細(xì)，分別精密稱取1.5g，加甲醇10mL，時時振搖，浸漬1h，濾過，濾液濃縮至約1mL，作為成品樣品溶液。4.2.3

結(jié)果判定4.2.3.1

對照溶液按照2015版《中華人民共和國藥典》四部薄層色譜法試驗規(guī)定，吸取上述對照溶液5μL，點樣于羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯（4:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%磷鉬酸乙醇溶液，在110℃、10min條件下，立即檢視，應(yīng)有藍(lán)色斑點。4.2.3.2

空白溶液在與對照溶液色譜相應(yīng)的位置上，無斑點呈現(xiàn)。4.2.3.3

陰性樣品溶液在與對照溶液色譜相應(yīng)的位置上，無相同的斑點。4.2.3.4

3批成品樣品溶液在與對照溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點。4.2.4

分析方法研究4.2.4.1

專屬性4.2.4.1.1

定義當(dāng)存在其他成分，如雜質(zhì)、降解物、添加物（緩沖液、賦形劑、穩(wěn)定劑）等時，采用的分析方法能正確測定出被測成分的特性。不含被測成分的供試品均不得干擾檢測。在本試驗中，采用對照溶液、空白溶液、陰性樣品溶液、成品樣品溶液，在同一硅膠G薄層板上做斑點顏色對比，其他成分的存在應(yīng)對其檢測結(jié)果無干擾。4.2.4.1.2

具體方案取“4.2.2樣品制備”的各樣品溶液各5μL，點樣于羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯（4:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%磷鉬酸乙醇溶液，在110℃、10min條件下，立即檢視。4.2.4.1.3

判定標(biāo)準(zhǔn)成品樣品溶液色譜中，在與對照溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色斑點；空白溶液與陰性樣品溶液色譜中，在與對照溶液色譜相應(yīng)的位置上，則無上述斑點呈現(xiàn)。4.2.4.2

重復(fù)性4.2.4.2.1

定義分析方法的重復(fù)性是指在同樣的操作條件下，檢測結(jié)果在較短時間間隔的精密度。本試驗中的重復(fù)性是對不同批號的樣品進(jìn)行連續(xù)多次測定，比較測定結(jié)果的精密度。4.2.4.2.2

具體方案取“4.2.2樣品制備”的對照溶液、3批成品樣品溶液各5μL，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯（4:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%磷鉬酸乙醇溶液，在110℃、10min條件下，立即檢視，應(yīng)有藍(lán)色斑點。以此法，對3批強力腦心康膠囊樣品連續(xù)重復(fù)測定3次，比較3次的測定結(jié)果，考察該檢測方法的重復(fù)性。4.2.4.2.3

判定標(biāo)準(zhǔn)對3個批號的強力腦心康膠囊樣品連續(xù)重復(fù)測定3次，測定結(jié)果應(yīng)一致，無明顯差異。4.2.4.3

耐用性4.2.4.3.1

定義在測定條件有較小變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為該檢測方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。本實驗中的耐用性是對不同廠家的硅膠G薄層板進(jìn)行連續(xù)多次測定，比較測定結(jié)果的耐用性。4.2.4.3.2

具體方案取“4.2.2樣品制備”的對照溶液、3批成品樣品溶液各5μL，分別點樣于同一個不同廠牌的羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯（4:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%磷鉬酸乙醇溶液，在110℃、10min條件下，立即檢視，比較3個廠牌的測定結(jié)果，考察該檢測方法的耐用性。4.2.4.3.3

判定標(biāo)準(zhǔn)對3個批號的強力腦心康膠囊樣品，采用3個廠牌的硅膠G薄層板重復(fù)測定3次，測定結(jié)果應(yīng)一致，無明顯差異。4.2.5

結(jié)果4.2.5.1

專屬性實驗在本實驗中，采用對照溶液、空白溶液、陰性樣品溶液、成品樣品溶液，在同一硅膠G薄層板上做斑點顏色對比，其他成分的存在對其檢測結(jié)果無干擾，空白樣品與陰性樣品沒有相同斑點呈