(高清版)GBT 42239.1-2022 洗滌用酶制劑 第1部分：堿性蛋白酶

洗滌用酶制劑第1部分：堿性蛋白酶2022-12-30發(fā)布2022-12-30實(shí)施國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是GB/T42239《洗滌用酶制劑》的第1部分。GB/T42239已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：堿性蛋白酶；——第2部分：脂肪酶。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)提出。本文件由全國表面活性劑和洗滌用品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC272)歸口。本文件起草單位：中國日用化學(xué)研究院有限公司、深圳市芭格美生物科技有限公司、諾維信(中國)投資有限公司、杰能科(中國)生物工程有限公司、英聯(lián)酶制劑貿(mào)易(上海)有限公司、上海丹尼悅生物科技有限公司、廣東溢多利生物科技股份有限公司、上海開米科技有限公司、福建省夢(mèng)嬌蘭日用化學(xué)品有限公司、廣東中聯(lián)邦精細(xì)化工有限公司、黃河三角洲京博化工研究院有限公司、中國皮革制鞋研究院有限公司、大連潔仕清潔用品有限公司、南京百斯杰生物工程有限公司、中輕日用化學(xué)檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司。Ⅱ洗滌用品行業(yè)是酶制劑重要的應(yīng)用領(lǐng)域之一，制定GB/T42239《洗滌用酶制劑》,對(duì)于我國洗滌用品行業(yè)規(guī)范含酶類洗滌用品細(xì)分領(lǐng)域的市場(chǎng)，指導(dǎo)行業(yè)內(nèi)企業(yè)創(chuàng)新開發(fā)新產(chǎn)品，杜絕不良企業(yè)欺騙消費(fèi)者，促進(jìn)洗滌用品行業(yè)快速、良性發(fā)展具有重要的意義。GB/T42239《洗滌用酶制劑》擬由以下2個(gè)部分構(gòu)成：——第1部分：堿性蛋白酶，目的在于確立洗滌用堿性蛋白酶的分類和技術(shù)要求；——第2部分：脂肪酶，目的在于確立洗滌用脂肪酶的分類和技術(shù)要求。1洗滌用酶制劑第1部分：堿性蛋白酶存和保質(zhì)期。本文件適用于經(jīng)微生物發(fā)酵、提純等工藝制得的用于洗滌劑工業(yè)的堿性蛋白酶。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T191包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志GB4789.2食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定GB4789.3食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)GB/T6003.1試驗(yàn)篩技術(shù)要求和檢驗(yàn)第1部分：金屬絲編織網(wǎng)試驗(yàn)篩GB/T6005試驗(yàn)篩金屬絲編織網(wǎng)、穿孔板和電成型薄板篩孔的基本尺寸GB/T6368表面活性劑水溶液pH值的測(cè)定電位法GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB15258化學(xué)品安全標(biāo)簽編寫規(guī)定JJF1070定量包裝商品凈含量計(jì)量檢驗(yàn)規(guī)則QB/T2739洗滌用品常用試驗(yàn)方法滴定分析(容量分析)用試驗(yàn)溶液的制備3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。能在堿性反應(yīng)條件下切斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鍵，使蛋白質(zhì)分子變成小分子多肽和氨基酸的酶。蛋白酶在堿性條件下催化蛋白質(zhì)水解的能力。注：堿性蛋白酶活力以堿性蛋白酶活力單位表示，1g固體酶粉(或1mL液體酶),在一定溫度和pH條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，即為1個(gè)酶活力單位，以U/g或U/mL表示。4產(chǎn)品分類按產(chǎn)品形態(tài)分為液體劑型和固體劑型。25要求5.1外觀和理化性能要求產(chǎn)品的外觀和理化性能指標(biāo)應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1外觀和理化性能指標(biāo)指標(biāo)液體劑型固體劑型外觀淺黃色至棕褐色液體白色、灰白色、黃褐色或其他顏色可自由流動(dòng)的顆粒pH(25℃,1%水溶液)≤酶活力“/(U/g或U/mL)≥標(biāo)示值干燥失重/%≤——酶活力標(biāo)示值由供需雙方按合同規(guī)定或生產(chǎn)商明示，酶活力值測(cè)定按附錄A仲裁。酶活力只適用于對(duì)同一種堿性蛋白酶的質(zhì)量控制，不能用于不同種類堿性蛋白酶的比較；不同種類的堿性蛋白酶，水解底物的方式和特性不同，酶活力值的高低并不代表實(shí)際去污效果。5.2微生物限量用于食品用洗滌劑的酶制劑，微生物限量應(yīng)符合表2規(guī)定。表2微生物限量指標(biāo)菌落總數(shù)/(CFU/g或CFU/mL)≤50000大腸菌群/(CFU/g或CFU/mL)≤5.3定量包裝要求每批產(chǎn)品的銷售包裝凈含量應(yīng)符合JJF1070的要求。6試驗(yàn)方法6.1通則除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和GB/T6682中規(guī)定的三級(jí)或以上的水。取適量樣品，置于干燥潔凈的透明實(shí)驗(yàn)器皿內(nèi)，在非直射光條件下進(jìn)行觀察。按GB/T6368的規(guī)定進(jìn)行。3GB/T42239.1—20226.4酶活力按照附錄A進(jìn)行，也可以參考附錄B進(jìn)行。6.5干燥失重6.5.1儀器6.5.1.1電熱干燥箱。6.5.1.2分析天平：精度為0.0001g。6.5.1.3稱量瓶。用烘干至恒重的稱量瓶稱取2g試樣(稱準(zhǔn)至士0.001g),置于103℃±2℃電熱干燥箱中，將蓋取下，側(cè)放在稱量瓶旁，烘干2h,取出，加蓋，放入干燥器中冷卻至室溫，稱量。6.5.3結(jié)果計(jì)算干燥失重w?以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，按式(1)計(jì)算：式中：w?——樣品的干燥失重；m?——干燥前稱量瓶加樣品的質(zhì)量，單位為克(g);m?——干燥后稱量瓶加樣品的質(zhì)量，單位為克(g);m——稱量瓶的質(zhì)量，單位為克(g)。以兩次平行測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示至小數(shù)點(diǎn)后一位作為測(cè)定結(jié)果。按照附錄C進(jìn)行。6.7菌落總數(shù)按GB4789.2的規(guī)定進(jìn)行。6.8大腸菌群按GB4789.3的規(guī)定進(jìn)行。6.9凈含量按JJF1070的規(guī)定進(jìn)行。7檢驗(yàn)規(guī)則7.1檢驗(yàn)分類7.1.1出廠檢驗(yàn)出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目為表1規(guī)定的外觀、酶活力。當(dāng)適用于食品用洗滌劑產(chǎn)品時(shí)，增加表2規(guī)定的項(xiàng)目。4型式檢驗(yàn)為表1規(guī)定的全部項(xiàng)目。當(dāng)適用于食品用洗滌劑產(chǎn)品時(shí)，增加表2規(guī)定的項(xiàng)目。在下列情況下應(yīng)進(jìn)行型式檢驗(yàn)：b)生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)設(shè)備、原材料、催化劑等變化或不正常，以及生產(chǎn)管理要素(包括人員素質(zhì))的變化可能影響產(chǎn)品質(zhì)量和性能時(shí)；c)長期停產(chǎn)后再恢復(fù)生產(chǎn)時(shí)；d)出廠檢驗(yàn)結(jié)果與上次的型式檢驗(yàn)有較大差異時(shí)；e)市場(chǎng)監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)、使用單位提出型式檢驗(yàn)要求時(shí)。7.2組批與抽樣原則產(chǎn)品應(yīng)經(jīng)生產(chǎn)廠的質(zhì)量檢驗(yàn)部門按本文件規(guī)定的檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)合格，并出具產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)合格證方可出廠。收貨單位應(yīng)在到貨一個(gè)月內(nèi)，憑合格證驗(yàn)收，必要時(shí)可按7.2.3抽樣驗(yàn)收。根據(jù)批量大小，按表3確定樣本大小，從批中隨機(jī)抽取樣本單位。在取樣前應(yīng)將選定的樣本包裝中的樣品混合均勻，在保證均勻的前提下方可取樣。表3批量和樣本大小單位為桶/箱/袋批量樣本大小2347.3判定規(guī)則與復(fù)檢外觀指標(biāo)檢驗(yàn)不合格，可重新抽樣進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果仍不合格則判該批產(chǎn)品不合格。理化指標(biāo)檢驗(yàn)結(jié)果按修約值比較法修約后與指標(biāo)比較判定合格與否，如有一項(xiàng)指標(biāo)不合格，可重新取兩倍箱樣本采取樣品，對(duì)不合格項(xiàng)進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果仍不合格，則判該批產(chǎn)品不合格。交收雙方因檢驗(yàn)結(jié)果不同，如不能取得協(xié)議時(shí)，可商請(qǐng)仲裁檢驗(yàn)，仲裁檢驗(yàn)結(jié)果為最后依據(jù)。產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)及仲裁機(jī)構(gòu)抽查檢驗(yàn)時(shí)不進(jìn)行二次抽樣。收貨單位如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量不符合本文件規(guī)定的要求，應(yīng)在到貨1個(gè)月內(nèi)向生產(chǎn)者交涉。若因檢驗(yàn)結(jié)果不同，不能取得協(xié)議時(shí)，雙方應(yīng)按7.2.3取樣。取樣總量不應(yīng)少于450g,將選取的試樣仔細(xì)混勻后，分別裝入3個(gè)潔凈干燥的樣品瓶中，簽封。標(biāo)簽上應(yīng)注明產(chǎn)品名稱、規(guī)格、批號(hào)、生產(chǎn)者名稱、取樣日期、取樣人。交收雙方各執(zhí)一份，第三份簽封后，備仲裁檢驗(yàn)用。樣品存放于暗處，按照建議貯存溫度貯存，保存期1個(gè)月。仲裁檢驗(yàn)結(jié)果為最后依據(jù)。58.1標(biāo)志產(chǎn)品的外包裝使用符合GB/T191要求的標(biāo)志。產(chǎn)品的包裝上應(yīng)貼有牢固的標(biāo)簽。標(biāo)簽內(nèi)容應(yīng)包括產(chǎn)品名稱、凈含量、生產(chǎn)者和(或)經(jīng)銷者的名稱、地址和聯(lián)系方式、生產(chǎn)日期和保質(zhì)期、貯存條件、批號(hào)及其他需要標(biāo)示的內(nèi)容?；瘜W(xué)品安全標(biāo)簽內(nèi)容應(yīng)符合GB15258的要求。產(chǎn)品的內(nèi)包裝和(或)包裝容器的內(nèi)涂料應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定。產(chǎn)品在運(yùn)輸過程中應(yīng)輕拿輕放，不應(yīng)倒置，嚴(yán)防雨淋和暴曬，不應(yīng)在箱上踩踏和堆放重物。運(yùn)輸工產(chǎn)品應(yīng)貯存在陰涼干燥的環(huán)境下。不應(yīng)與有毒、有害、有腐蝕性的物質(zhì)同存。堆垛要采取必要的防護(hù)措施，堆垛高度要適當(dāng)，避免損壞運(yùn)輸包裝。8.5保質(zhì)期產(chǎn)品在25℃以下，保質(zhì)期不少于12個(gè)月。在規(guī)定的運(yùn)輸和包裝貯存條件下，保質(zhì)期內(nèi)的酶活力不應(yīng)低于標(biāo)示酶活力。注：超過保質(zhì)期的產(chǎn)品仍具有使用價(jià)值，使用時(shí)重新測(cè)定酶活力。6(規(guī)范性)堿性蛋白酶酶活力的測(cè)定福林法(仲裁法)A.1方法概要堿性蛋白酶在一定的溫度與pH條件下，水解酪蛋白底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等),在堿性條件下，將福林試劑(Folin)還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，用分光光度計(jì)于波長680nm下測(cè)定溶液的吸光度。酶活力與吸光度成比例，由此可以計(jì)算產(chǎn)品的酶活力。A.2儀器和設(shè)備A.2.2紫外-可見分光光度計(jì)。A.2.7離心機(jī)。A.2.8恒溫水浴鍋：精度為±0.2℃。A.2.9移液器。A.3試劑和溶液于2000mL磨口回流裝置中加入鎢酸鈉(Na?WO?·2H?O)100g、鉬酸鈉(Na?MoO?·2H?O)25.0g、水700mL、85%磷酸50mL、濃鹽酸100mL。小火沸騰回流10h。取下回流冷卻器，在通風(fēng)櫥和數(shù)滴濃溴水(99%),再微沸15min,以除去多余的溴(冷后仍有綠色應(yīng)再加溴水，再煮沸除去過量的溴),冷卻，加水定容至1000mL?；靹颍^濾。制得的試劑應(yīng)呈A.3.2福林試劑使用溶液一份福林試劑與兩份水混合，搖勻。也可使用市售福林溶液配制。A.3.3碳酸鈉溶液(42.4g/L)稱取無水碳酸鈉(Na?CO?)42.4g,用水溶解并定容至1000mL。A.3.4三氯乙酸(65.4g/L)稱取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000mL。稱取氫氧化鈉片劑20.0g,加水900mL并攪拌溶解。待溶液冷卻到室溫后續(xù)水定容至1000mL,攪拌均勻。7A.3.6鹽酸溶液(1mol/L、0.1mol/L)按QB/T2739配制。A.3.7硼酸緩沖溶液(pH=10.5)稱9.54g硼酸鈉，1.60g氫氧化鈉，加900mL水，攪拌至均勻。用pH計(jì)將1mol/L鹽酸溶液或0.5mol/L氫氧化鈉溶液(A.3.5)調(diào)整pH至10.5±0.05,定容至1000mL。A.3.8酪蛋白溶液(10.0g/L)稱取1.000g標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白(NICPBP國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)),加入約80mL相應(yīng)的緩沖溶液，再加入磁力攪拌子，在磁力攪拌器上攪拌至均勻、無較大顆粒后，打開加熱功能緩慢加熱至酪蛋白全部溶解，注意加熱時(shí)間以免煮沸導(dǎo)致蛋白變性，冷卻到室溫后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用緩沖溶液稀釋定容。定容前檢查并調(diào)整pH至10.5。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為3d。使用前重新確認(rèn)并調(diào)整pH至10.5。不同來源或批號(hào)的酪蛋白對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響。如使用不同的酪蛋白作為底物，使用前應(yīng)與以上標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白進(jìn)行結(jié)果比對(duì)。A.3.9L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100μg/mL)精確稱取0.100g預(yù)先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸，用1mol/L鹽酸溶液(A.3.6)60mL,溶解后定容至100mL,即為1mg/mL的L-酪氨酸溶液。吸取1mg/mL的L-酪氨酸溶液10.00mL,用0.1mol/L鹽酸溶液(A.3.6)定容至100mL,即得到100μg/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。A.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按表A.1用移液管精密量取配制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。L-酪氨酸稀釋液應(yīng)在稀釋后立即進(jìn)行測(cè)定。表A.1L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制管號(hào)L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(A.3.9)的體積mL加水的體積mL000119228337446555分別取上述溶液各1.00mL(應(yīng)做平行試驗(yàn)),各加5.00mL碳酸鈉溶液(A.3.3)、1.00mL福林試劑使用溶液(A.3.2),振蕩均勻，置于40℃±0.2℃水浴中顯色20min,取出，用分光光度計(jì)于680nm波長處，用10mm比色皿，以不含L-酪氨酸的0號(hào)管為空白，分別測(cè)定其吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，L-酪氨酸的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。8GB/T42239.1—2022利用回歸方程，計(jì)算出當(dāng)吸光度為1時(shí)的L-酪氨酸的量(μg),即為吸光常數(shù)K值。其K值應(yīng)在95～100范圍內(nèi)。如不符合，應(yīng)重新配制試劑，進(jìn)行試驗(yàn)。A.4.2樣品測(cè)定A.4.2.1待測(cè)酶液的制備液體劑型：精密量取1mL試樣，用緩沖溶液溶解稀釋到一定濃度并記錄其稀釋倍數(shù)。固體劑型：稱取1g試樣(稱準(zhǔn)至0.001g),然后加入一定的緩沖溶液溶解并記錄質(zhì)量(克),用保鮮膜密封，于磁力攪拌器上攪拌15min以上，濾紙過濾或于離心機(jī)(4000r/min,5min)離心后備用。推薦濃度范圍為酶活力10U/mL～15U/mL。A.4.2.2測(cè)定先將酪蛋白溶液(A.3.8)放入40℃士2℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min。取四支試管(一支空白管，三支樣品管),分別準(zhǔn)確加入1mL稀釋好的待測(cè)酶液，于40℃±2℃恒溫水浴中，預(yù)熱2min。然后向空白管中加入2mL三氯乙酸(A.3.4),再向樣品管中準(zhǔn)確加入1mL酪蛋白溶液(A.3.8),搖勻準(zhǔn)確計(jì)時(shí)10min后，立即向樣品管中補(bǔ)加2mL三氯乙酸(A.3.4);向空白管中準(zhǔn)確加入1mL酪蛋白溶液(A.3.8)。將四支試管取出搖勻后分別用慢速定性濾紙過濾備用。準(zhǔn)確吸取1mL濾液分別置于另外四支試管中，再于四支試管中分別依次加入5mL碳酸鈉溶液(A.3.3)后加入1mL福林試劑使用溶液(A.3.2),搖勻立即置于40℃±2℃恒溫水浴中顯色20min,取出備用。于680nm波長處，用10mm比色皿，分別測(cè)定其吸光度。A.4.3結(jié)果計(jì)算從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品最終稀釋液中L-酪氨酸的濃度p?,單位為μg/mL。樣品的酶活力X,按式(A.1)計(jì)算：……………(A.1)式中：X?——樣品的酶活力，單位為酶活力單位(U/mL或U/g);4——反應(yīng)試劑的總體積，單位為毫升(mL);n?——樣品的稀釋倍數(shù)；10——反應(yīng)時(shí)間，單位為分(min)。以兩次平行測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示至個(gè)位作為測(cè)定結(jié)果。A.5精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值的算術(shù)平均值的3%,以大于3%的情況不超過5%為前提。9GB/T42239.1—2022(資料性)堿性蛋白酶活力的測(cè)定紫外分光光度法B.1方法概要堿性蛋白酶在一定的溫度與pH條件下，水解酪蛋白底物產(chǎn)生酪氨酸，然后加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，并沉淀未水解的酪蛋白，濾液中的酪氨酸對(duì)紫外光有吸收，可用紫外分光光度法于275nm下測(cè)定。根據(jù)吸光度與酶活力的比例關(guān)系計(jì)算其酶活力。不同的蛋白酶制劑其紫外法結(jié)果與福林法結(jié)果的換算系數(shù)不同，參考比值為紫外法相對(duì)于福林法的1.50倍～1.80倍。如需要，相關(guān)方可根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，確定兩個(gè)方法的換算系數(shù)。B.2儀器和設(shè)備B.3試劑和溶液B.4分析步驟按福林法的表A.1配制不同濃度的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后，直接用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度(A),并計(jì)算K值。K值應(yīng)在130～135范圍內(nèi)，如不符合，應(yīng)重新配制試劑，進(jìn)行試驗(yàn)。B.4.2待測(cè)酶液的制備按A.4.2.1制備的樣品稀釋液最終的濃度應(yīng)在15U/mL～25U/mL范圍內(nèi)。B.4.3測(cè)定操作按A.4.2.2中的取液、反應(yīng)、靜止沉淀，其中三氯乙酸取樣量改為5mL,直至過濾。濾液用紫外分光光度計(jì)，在275nm波長處，測(cè)定其吸光度。當(dāng)測(cè)試結(jié)果不平行，可以考慮將加入三氯乙酸的試樣溶液返回到水浴中保溫30min,然后再測(cè)定吸光度。B.5結(jié)果計(jì)算從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品最終稀釋液中L-酪氨酸的濃度p?,單位為μg/mL。樣品的酶活力X?按式(B.1)計(jì)算：……………X?——樣品的酶活力，單位為酶活力單位(U/mL或U/g);p?——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣品最終稀釋液中L-酪氨酸的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);n?——稀釋倍數(shù)；7反應(yīng)試劑的總體積，單