熒光分光光度計(jì)檢定規(guī)程

JJG537—20061熒光分光光度計(jì)檢定規(guī)程1范圍本規(guī)程適用于熒光分光光度計(jì)的首次檢定、后續(xù)檢定和使用中的檢驗(yàn)。2概述某些物質(zhì)受到光照射而被激發(fā)之后,會(huì)發(fā)射出比照射波長(zhǎng)稍長(zhǎng)的光,這種光稱為熒光。熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度有如下關(guān)系:F=k′ΦI0(1-e-εLc)式中:F—熒光強(qiáng)度;k′儀器常數(shù);I0—激發(fā)光強(qiáng)度;ε熒光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù);L—熒光物質(zhì)液層的厚度;c熒光物質(zhì)的濃度;Φ—熒光量子效率。對(duì)于給定物質(zhì)來(lái)說(shuō),當(dāng)激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度固定、液層的厚度固定、溶液的濃度較低時(shí),熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度c有如下簡(jiǎn)單的關(guān)系:F=kc熒光分光光度計(jì)(以下簡(jiǎn)稱儀器)就是根據(jù)上述原理,對(duì)可發(fā)射熒光的物質(zhì)進(jìn)行定性、定量測(cè)量的分析儀器。儀器主要由光源系統(tǒng)、激發(fā)單色器系統(tǒng)、樣品室、發(fā)射單色器系統(tǒng)、探測(cè)器系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。儀器的單色器可分為兩類:A類是色散型單色器;B類是濾光片單色器。3計(jì)量性能要求3.1波長(zhǎng)示值誤差與重復(fù)性3.1.1A類單色器波長(zhǎng)示值誤差限和波長(zhǎng)重復(fù)性應(yīng)符合以下要求:波長(zhǎng)示值誤差限:優(yōu)于±2.0nm;波長(zhǎng)重復(fù)性:≤1.0nm。3.1.2B類單色器濾光片透光特性B類單色器配置的玻璃濾光片、干涉濾光片標(biāo)稱值誤差應(yīng)符合以下要求:玻璃濾光片:標(biāo)稱值±10nm;2干涉濾光片:標(biāo)稱值±5nm。3.2檢出極限用硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液檢定儀器的檢出極限:配置A類單色器的儀器,其檢出極限為5×10-10g/mL;配置B類單色器的儀器,其檢出極限為1×10-8g/mL。在一臺(tái)儀器上同時(shí)配置A、B兩類單色器的,可參照B類單色器的指標(biāo)。3.3測(cè)量線性儀器測(cè)量結(jié)果的線性γ≥0.995。對(duì)指針式直讀電表儀器,若配套指示儀表準(zhǔn)確度低于0.5級(jí),此項(xiàng)可不檢定。3.4熒光光譜峰值強(qiáng)度重復(fù)性儀器測(cè)量熒光光譜峰值的重復(fù)性≤1.5%。3.5穩(wěn)定度3.5.1在10min內(nèi)零線漂移≤0.5%。3.5.2熒光強(qiáng)度示值上限在10min內(nèi)的漂移不超過(guò)±1.5%。4通用技術(shù)要求4.1外觀與初步檢查4.1.1儀器應(yīng)有下列標(biāo)志:儀器名稱、型號(hào)、制造廠名、G標(biāo)志、出廠時(shí)間和儀器編號(hào)。4.1.2儀器的各緊固件應(yīng)緊固良好,各調(diào)節(jié)旋鈕、按鍵和開(kāi)關(guān)均能正常工作。電纜線的接插件應(yīng)接觸良好,外觀不應(yīng)有明顯的機(jī)械損傷。4.1.3儀器的指示儀表應(yīng)工作正常,刻線應(yīng)清晰、均勻。指針的寬度不大于刻線的寬度,并應(yīng)與刻線平行。4.1.4旋動(dòng)指示儀表的“調(diào)零”和“滿度”旋鈕時(shí),電表指針應(yīng)平穩(wěn)無(wú)跳動(dòng)現(xiàn)象。4.1.5儀器配置的濾光片附件不得有灰塵、油污或影響透光性的斑點(diǎn)存在。4.2絕緣電阻儀器在不工作的狀態(tài)下,試驗(yàn)電壓500V時(shí),電源進(jìn)線與殼體之間的絕緣電阻不小于20MΩ。5計(jì)量器具控制計(jì)量器具控制包括:首次檢定、后續(xù)檢定和使用中檢驗(yàn)。5.1檢定條件5.1.1環(huán)境條件環(huán)境溫度(20±10)℃,且相對(duì)穩(wěn)定;相對(duì)濕度不大于85%;JJG537—20063電源電壓(220±22)V。5.1.2檢定設(shè)備工作標(biāo)準(zhǔn)熒光池:其配套誤差不應(yīng)大于0.5%。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):波長(zhǎng)示值誤差±1.0nm。秒表:分度值0.1s。交流電壓表:150/500V,準(zhǔn)確度1.0級(jí)。兆歐表:試驗(yàn)電壓500V。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液所需的設(shè)備及器材見(jiàn)附錄A。5.1.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5.1.3.1硫酸奎寧熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.1.3.2萘甲醇溶液:國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.1.4工作標(biāo)準(zhǔn)溶液5.1.4.10.05mol/L硫酸溶液。5.1.4.2以0.05mol/L硫酸作為溶劑的硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液,其質(zhì)量濃度分別為:1×10-9,1×10-7,4×10-7,8×10-7和1×10-6g/mL。5.2檢定項(xiàng)目表1檢定項(xiàng)目表后續(xù)檢定外觀檢查++-單色器波長(zhǎng)示值誤差與重復(fù)性++-濾光片透光特性++-檢出極限+++測(cè)量線性++-重復(fù)性+++穩(wěn)定度+--絕緣電阻+--注:1.“+”為需檢項(xiàng)目;“-”為不需檢項(xiàng)目。2.經(jīng)安裝及維修后可能對(duì)儀器有較大影響時(shí),其后續(xù)檢定按首次檢定項(xiàng)目進(jìn)行。5.3檢定方法儀器應(yīng)平穩(wěn)地放在工作臺(tái)上,無(wú)強(qiáng)光直射在儀器上;儀器周圍無(wú)強(qiáng)磁場(chǎng)、電場(chǎng)干擾;無(wú)振動(dòng);無(wú)強(qiáng)氣流影響。檢定前儀器應(yīng)預(yù)熱20min。配置濾光片的儀器,必須安裝好濾光片,更換濾光片應(yīng)先切斷電源。5.3.1外觀與初步檢查按4.1的要求進(jìn)行。JJG537—200645.3.2A類單色器儀器波長(zhǎng)示值誤差與波長(zhǎng)重復(fù)性5.3.2.1氙燈亮線方法注:氙燈亮線方法,一定要依據(jù)儀器使用說(shuō)明書的方法進(jìn)行。以下方法只是測(cè)量步驟的一般性描述。(a)激發(fā)側(cè)單色器波長(zhǎng)示值誤差與波長(zhǎng)重復(fù)性將發(fā)射側(cè)單色器置零級(jí)位置,將漫反射板(或無(wú)熒光的白色濾紙條)放入樣品室,儀器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)置為“快”,掃描速度設(shè)置為“中”或采用手動(dòng)方式,使用實(shí)際可行的最窄狹縫寬度,對(duì)激發(fā)側(cè)單色器在(350~550)nm的波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描,在所得到的譜圖上尋找450.1nm附近的光譜峰,并確定其峰值位置。連續(xù)測(cè)量三次,按公式(1)和(2)分別計(jì)算波長(zhǎng)示值誤差和重復(fù)性。波長(zhǎng)示值誤差:Δλλi-λr(nm)(1)式中:λi—波長(zhǎng)測(cè)量值;λr—參考波長(zhǎng)值(氙燈亮線參考波長(zhǎng)峰值:450.1nm)。波長(zhǎng)重復(fù)性:δλ=maxλi-λi(nm)(2)(b)發(fā)射側(cè)單色器波長(zhǎng)示值誤差與波長(zhǎng)重復(fù)性將激發(fā)側(cè)單色器置零級(jí)位置,將漫反射板(或無(wú)熒光的白色濾紙條)放入樣品室,儀器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)置為“快”,掃描速度設(shè)置為“中”或采用手動(dòng)方式,使用實(shí)際可行的最窄狹縫寬度,對(duì)發(fā)射側(cè)單色器(350~550)nm的波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描,在所得到的譜圖上尋找450.1nm附近的光譜峰,并確定其峰值位置。連續(xù)測(cè)量三次,按公式(1)和(2)分別計(jì)算波長(zhǎng)示值誤差和重復(fù)性。注:對(duì)一些型號(hào)的儀器,其發(fā)射側(cè)單色器波長(zhǎng)示值誤差與波長(zhǎng)重復(fù)性的測(cè)量,可以用測(cè)量汞燈譜線的方法。具體測(cè)量方法見(jiàn)附錄B或儀器使用說(shuō)明書。5.3.2.2萘峰位置方法(a)激發(fā)側(cè)單色器波長(zhǎng)示值誤差與波長(zhǎng)重復(fù)性將發(fā)射側(cè)波長(zhǎng)設(shè)定在331nm處,將盛有萘甲醇溶液(1×10-4g/mL)的熒光池放入樣品室,儀器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)置為“快”,掃描速度設(shè)置為“中”或采用手動(dòng)方式,使用實(shí)際可行的狹縫寬度(1~3)nm,對(duì)激發(fā)側(cè)單色器(240~350)nm的波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描,在所得到的譜圖上尋找290nm光譜峰,并確定其峰值位置。連續(xù)測(cè)量三次,按公式(1)和(2)分別計(jì)算波長(zhǎng)示值誤差和重復(fù)性。(b)發(fā)射側(cè)單色器波長(zhǎng)示值誤差與波長(zhǎng)重復(fù)性:將激發(fā)側(cè)波長(zhǎng)設(shè)定在290nm處,將盛有萘-甲醇溶液(1×10-4g/mL)的熒光池放JJG537—20065入樣品室,儀器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)置為“快”,掃描速度設(shè)置為“中”或采用手動(dòng)方式,使用的狹縫寬度(1~3)nm,對(duì)發(fā)射側(cè)單色器(240~400)nm的波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描,在所得到的譜圖上尋找331nm的光譜峰,并確定其峰值位置。連續(xù)測(cè)量三次,按公式(1)和(2)分別計(jì)算波長(zhǎng)示值誤差和重復(fù)性。5.3.3單色器濾光片的檢定5.3.3.1帶通型濾光片的透光特性用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量被檢儀器的濾光片在各波長(zhǎng)處的透射比,繪制透射比 波長(zhǎng)特性曲線(見(jiàn)圖1)。由曲線求出最大透射比Tmax對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)λmax和透射比為Tmax/2時(shí)對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)λ1,λ2,則濾光片峰值波長(zhǎng)誤差:Δλ=λ-λmax(3)式中:λ濾光片峰值波長(zhǎng)標(biāo)稱值。圖15.3.3.2截止型濾光片截止型濾光片的透射光特性用半高波長(zhǎng)表示。測(cè)量方法按照5.3.3.1,由圖2所示曲線求出最大透射比Tmax,Tmax/2所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)λ3為半高波長(zhǎng)。圖25.3.4檢出極限用0.05mol/L硫酸溶液做空白溶液,A類單色器選取質(zhì)量濃度為1×10-9g/mL,BJJG537—20066類單色器選取質(zhì)量濃度為1×10-7g/mL硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液。靈敏度置最高擋,選擇適當(dāng)?shù)莫M縫寬度。根據(jù)激發(fā)波長(zhǎng)在350nm、發(fā)射波長(zhǎng)在450nm左右的原則,設(shè)定兩側(cè)的波長(zhǎng)或選擇濾光片。對(duì)空白溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行連續(xù)交替11次測(cè)量。如果在測(cè)量中,有1次數(shù)據(jù)確認(rèn)是由外界干擾或操作引起的粗大誤差,應(yīng)將該次數(shù)據(jù)剔除。由下式計(jì)算每次測(cè)量的熒光強(qiáng)度:Fi=Fi1-Fi0式中:Fi1—標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度;Fi0—空白溶液的熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度測(cè)量值的平均值為:Fi=Fi式中:n—測(cè)量次數(shù)。檢出極限指二倍于標(biāo)準(zhǔn)偏差讀數(shù)的物質(zhì)濃度。用符號(hào)DL來(lái)表示;(g/mL)DL×2(g/mL)式中:—11次測(cè)量的平均熒光強(qiáng)度;c標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度;s單次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。s=5.3.5測(cè)量線性ii=1 (F-)2ii=1n-1(4)(5)(6)(7)用0.05mol/L硫酸溶液作空白溶液,適當(dāng)選擇靈敏度擋和狹縫,依次測(cè)量下面表2中的各質(zhì)量濃度硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)激發(fā)波長(zhǎng)在350nm、發(fā)射波長(zhǎng)在450nm左右的原則,設(shè)定兩側(cè)的波長(zhǎng)或選擇濾光片。表2硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液編號(hào)(j)1234標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(cj)1×10-74×10-78×10-71×10-6分別對(duì)表2中4種質(zhì)量濃度工作標(biāo)準(zhǔn)溶液與空白溶液進(jìn)行連續(xù)交替三次測(cè)量,計(jì)算每次測(cè)量的熒光強(qiáng)度平均值。用最小二乘法對(duì)4種標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度和熒光強(qiáng)度測(cè)量平均值進(jìn)行處理,得到線性相關(guān)系數(shù)γ,即為測(cè)量線性的檢定結(jié)果(最小二乘法公式見(jiàn)附錄D)。5.3.6光譜峰值強(qiáng)度的重復(fù)性根據(jù)激發(fā)波長(zhǎng)在350nm、發(fā)射波長(zhǎng)在450nm左右的原則,設(shè)定兩側(cè)的波長(zhǎng)或選擇JJG537—20067δF=3×100%(8)濾光片。用1×10-7g/mL的硫酸奎寧溶液,見(jiàn)光3min后δF=3×100%(8)500nm重復(fù)掃描三次或記錄儀器示值。光譜峰值強(qiáng)度的重復(fù)性由下式計(jì)算:maxFi-FiFi式中:Fi—光譜峰值強(qiáng)度讀數(shù)。5.3.7穩(wěn)定度5.3.7.1調(diào)節(jié)靈敏度中等程度。關(guān)閉光閘門,記錄10min內(nèi)的漂移。5.3.7.2置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)為450nm。置激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為10nm。漫反射板放入樣品室,調(diào)節(jié)靈敏度,使示值為90%,見(jiàn)光3min后,觀察10min內(nèi)示值的變5.3.8絕緣電阻儀器的電源插頭不接通電源,儀器的電源開(kāi)關(guān)置于接通狀態(tài),用500V兆歐表在儀器電源輸入電路與外殼之間施加500V直流試驗(yàn)電壓,穩(wěn)定5s后測(cè)量絕緣電阻。5.3.9其他對(duì)測(cè)量方法沒(méi)有完全包括在規(guī)程范圍內(nèi)的其他類型熒光分光光度計(jì),其主要技術(shù)指標(biāo)可參照上述檢定方法進(jìn)行檢定。技術(shù)要求可參考儀器說(shuō)明書注明的指標(biāo)。5.4檢定結(jié)果的處理5.4.1以上檢定數(shù)據(jù)均須記錄在檢定記錄紙上,其中有關(guān)項(xiàng)目應(yīng)填寫完整或注明在檢定證書或檢定結(jié)果通知書上。5.4.2經(jīng)檢定符合本規(guī)程規(guī)定的儀器,發(fā)給檢定證書(檢定證書背面格式見(jiàn)附錄F;不符合本規(guī)程規(guī)定的儀器,發(fā)給檢定結(jié)果通知書(檢定結(jié)果通知書背面格式同附錄F,指出不合格項(xiàng)目)。5.5檢定周期檢定周期為1年,在此期間,當(dāng)條件改變(例如更換光源燈、光電管等重要維修項(xiàng)目)或?qū)y(cè)量結(jié)果有懷疑時(shí),都應(yīng)進(jìn)行檢定。JJG537—20068附錄A檢定用工作標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制A.1試劑表A.1試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)試劑名稱硫酸奎寧硫酸化學(xué)式(C20H24O2N2)2·H2SO4·2H2OH2SO4相對(duì)分子質(zhì)量782.9398.03純度國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析純A.2設(shè)備與器材使用滴定管、移液管、無(wú)分度吸管、容量瓶須經(jīng)計(jì)量部分校正。表A.2設(shè)備及規(guī)格名稱規(guī)格名稱規(guī)格烘箱(0~220)℃容量瓶100,250,1000mL滴定管10mL量筒500mL移液管5mL稱量瓶20mL分析天平分度值0.01mg單標(biāo)線吸管1,10,25mLA.30.05mol/L硫酸溶液的配制將1000mL的容量瓶中加入適量的二次蒸餾水。用滴定管取濃硫酸2.7mL,注入容量瓶中。用二次蒸餾水稀釋至刻度,并混合均勻后放置備用。A.4硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制A.4.1配制500mL1×10-5g/mL硫酸奎寧溶液將硫酸奎寧固體試劑在干燥器中放置24h以上。在分析天平上準(zhǔn)確稱取5.00mg的硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于500mL容量瓶中。用適量0.05mol/L的硫酸溶液溶解之,然后用0.05mol/L硫酸稀釋至刻度線,并混合均勻。A.4.2配制250mL1×10-6g/mL硫酸奎寧溶液用單標(biāo)線移液管取25mL1×10-5g/mL硫酸奎寧溶液,傾入250mL容量瓶中加0.05mol/L硫酸溶液至刻度線,并混合均勻。JJG537—20069A.4.3依此類推配制其他濃度的硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液。所需標(biāo)準(zhǔn)母液的體積與質(zhì)量濃度見(jiàn)表A.3。為了清楚明了,將1×10-6g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液也列入表內(nèi)。表A.3硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法欲配標(biāo)準(zhǔn)溶液所取標(biāo)準(zhǔn)母液質(zhì)量濃度/(g/mL)配制體積/mL質(zhì)量濃度/(g/mL)所取體積/mL1×10-62501×10-5251×10-71001×10-6104×10-71001×10-548×10-71001×10-581×10-91001×10-71A.4.4在深色的玻璃瓶中貯存高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。溶液應(yīng)避光、低溫、密封保存。稀標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。濃溶液有效期時(shí)間為半年。JJG537—200610附錄B汞燈譜線的測(cè)量方法B.1發(fā)射側(cè)單色器波長(zhǎng)示值誤差與重復(fù)性將激發(fā)單色器置零級(jí)位置,在樣品室內(nèi)正確安好筆型汞燈。將漫反射板放入樣品架上。響應(yīng)時(shí)間“快”,掃描速度“慢”或手動(dòng),使用實(shí)際可行的最窄狹縫寬度。以汞譜線作參考波長(zhǎng),允許從中任選分布均勻的譜線作參考波長(zhǎng)。從短波向長(zhǎng)波方向?qū)Πl(fā)射單色器掃描。電表或記錄儀表最大讀數(shù)時(shí)的波長(zhǎng)為測(cè)量值,連續(xù)測(cè)量三次。按式(B.1)和(B.2)分別計(jì)算波長(zhǎng)示值誤差和重復(fù)性。Δλλi-λr(nm)(B.1)δλ=maxλi-λi(nm)(B.2)式中:λi—波長(zhǎng)測(cè)量值;λr—汞燈參考波長(zhǎng)值。B.2汞燈的參考波長(zhǎng)低壓汞燈光譜曲線的參考波長(zhǎng)及相對(duì)近似強(qiáng)度列在表B.1中。高壓汞燈也具有表B.1中的全部譜線。表B.1低壓汞燈光譜曲線的參考波長(zhǎng)波長(zhǎng)/nm相對(duì)強(qiáng)度波長(zhǎng)/nm相對(duì)強(qiáng)度波長(zhǎng)/nm相對(duì)強(qiáng)度253.65130365.0225435.8385296.7310365.4810546.0750312.5710366.335576.9615313.1515404.6645579.0710JJG537—200611附錄C熒光池成套性的測(cè)量選擇合適的濾光片,熒光池中裝入1×10-6g/mL的硫酸奎寧溶液,將熒光池帶有標(biāo)記的一面正對(duì)進(jìn)光方向,然后,將其中一只放入其他檢定項(xiàng)目合格的被檢儀器光路中。儀器示值調(diào)至90%處,測(cè)量其他熒光池,記錄熒光池間的儀器示值差。12附錄D最小二乘法計(jì)算公式Y(jié)=a+bXb=a=Y-bXγ=Sxx=∑X2-Syy2-Sxy=∑XY-注:表2中