實(shí)驗(yàn)十-PEG法誘導(dǎo)雞血細(xì)胞融合

實(shí)驗(yàn)十PEG法誘導(dǎo)雞血細(xì)胞融合CollegeofLifeScienceandTechnology,XINJIANGUnivercity2021/3/29星期一1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)體外細(xì)胞融合的基本原理。通過PEG誘導(dǎo)雞血細(xì)胞之間的融合實(shí)驗(yàn)，初步掌握細(xì)胞融合的基本方法。2021/3/29星期一2二、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞融合（cellfusion）又稱體細(xì)胞雜交，是指用人工方法使兩個或兩個以上的體細(xì)胞融合成異核體細(xì)胞，隨后，異核體同步進(jìn)入有絲分裂，核膜崩潰，來自兩個親本細(xì)胞的基因組合在一起形成只含有一個細(xì)胞核的雜種細(xì)胞（hybridcell）。細(xì)胞融合技術(shù)是研究細(xì)胞遺傳、基因定位、細(xì)胞免疫、病毒和腫瘤的重要手段。依據(jù)融合過程采用的助融劑的不同，細(xì)胞融合可分為：病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，如仙臺病毒(hemagglutinatingvirusofJapan,HVJ);化學(xué)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，如聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）;電場誘導(dǎo)的細(xì)胞融合；激光誘導(dǎo)的細(xì)胞融合。2021/3/29星期一3

聚乙二醇分子能改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，使細(xì)胞發(fā)生融合。細(xì)胞融合的頻率和活力與所用PEG分子質(zhì)量、濃度、作用時間、細(xì)胞的生理狀態(tài)與密度等有關(guān)。

2021/3/29星期一4骨髓間質(zhì)充質(zhì)干細(xì)胞移植后的細(xì)胞融合2021/3/29星期一5熒光標(biāo)記的細(xì)胞融合2021/3/29星期一6三．實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑儀器、用具：注射器、刻度離心管、離心機(jī)、血細(xì)胞記數(shù)板、水浴鍋、滴管、顯微鏡、燒杯、容量瓶、凹面載玻片、蓋玻片、酒精燈等。材料：成年家雞。2021/3/29星期一7（1）0.85%NaCl溶液:（2）GKN液：8.0gNaCl，0.4gKCl,1.77gNa2HPO4·2H2O，

0.69gNaH2PO4·H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚紅，溶于

1000ml重蒸水中。（3）50%（m/v）PEG溶液：取50gPEG(相對分子量=4000)放入100ml瓶中，高壓滅菌20min。讓PEG冷卻至50-60℃，勿讓其凝固。加入50ml預(yù)熱至50℃的GKN液，混勻，置

37℃?zhèn)溆?。?）

Hanks原液(10×)：NaCl80.0g；Na2HPO4·12H2O1.2g；

KCl4.0g；KH2PO40.6g；MgSO4·7H2O2.0g；葡萄糖10.0g；CaCl21.4g?！?/p>

試劑2021/3/29星期一8

稱取1.4g的CaCl2，融于30-50ml的重蒸水中。取1000ml的燒杯及容量瓶各一個，先放重蒸水800ml于燒杯中，然后按上述配方順序，逐一稱取藥品。必須在前一藥品完全溶解后，方可加入下一藥品，直到葡萄糖完全溶解后，再將已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至1000ml。（6）Hanks液：Hanks原液100ml，加重蒸水896ml，加0.5%酚紅4ml。配好的Hanks液，分裝包扎好貼上標(biāo)簽，經(jīng)過滅菌后，4℃保存。（7）詹納斯綠染液。2021/3/29星期一9（一）雞血細(xì)胞的體外融合1.雞血細(xì)胞的獲得用肝素溶液潤洗注射器，從家雞的翼根靜脈用注射器采血，注入試管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制成抗凝全血。2.雞血細(xì)胞儲備液的制備在抗凝全血的試管中，加入4倍體積的0.85%NaCl溶液，制成紅細(xì)胞儲備液，置于4℃冰箱內(nèi)可供一周內(nèi)使用。3、雞血細(xì)胞懸液的制備取細(xì)胞懸液1mL，加4mL0.85%NaCl溶液混勻，1200r/min離心5min，棄上清液，再加入5ml0.85%NaCl溶液按上述條件離心兩次（5分鐘，10分鐘）。最后，棄去上清液，加入10ml的GKN溶液，制成雞血細(xì)胞懸液。吸取0.5ml雞血細(xì)胞懸液，加入4.5ml的GKN液進(jìn)行稀釋。四、方法與步驟2021/3/29星期一10

吸取懸液1mL放入離心管中，加入4mLHanks液混勻，1000r/min離心5min，棄上清液，再加入適量GKN液，使成10%的懸液。4、PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合吸取0.5ml37℃的50%PEG溶液，慢慢沿著離心管壁逐滴加入，邊加邊輕搖離心管，使PEG與細(xì)胞混勻，然后在37℃水浴中靜置5---10min。5、染色和鏡檢

吸取細(xì)胞懸液，在凹面玻片上滴一滴，加入詹納斯綠染液混勻，染色5min后蓋上蓋玻片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察細(xì)胞融合情況。

2021/3/29星期一11

觀察時注意不同程度的融合現(xiàn)象。通常分為五個階段。①兩細(xì)胞膜接觸，粘連；②細(xì)胞膜形成穿孔；③兩細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)連通；④通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成一體；⑤細(xì)胞完全合并，形成一個含有兩個或多個核的圓形細(xì)胞。6．計(jì)算細(xì)胞融合率細(xì)胞融合率是指在顯微鏡的視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞其細(xì)胞核總數(shù)與該視野內(nèi)所有細(xì)胞（包括已融合細(xì)胞）的細(xì)胞核總數(shù)之比，通常以百分比表示，而且要進(jìn)行多個視野測定，再加以平均統(tǒng)計(jì)，更為準(zhǔn)確。2021/3/29星期一12細(xì)胞融合過程在形態(tài)上的變化

2021/3/29星期一13五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果2021/3/29星期一142021/3/29星期一15六、注意事項(xiàng)1.高壓滅菌過的PEG冷卻至50-60℃時就加入預(yù)熱至50℃的GKN液，勿讓其凝固。2.嚴(yán)格控制PEG的作用時間，通常處理細(xì)胞1－2min。3.終止PEG的作用時，緩慢加入5mlHanks液，輕輕吹打，以免融合的細(xì)胞分離或破裂。2021/3/29星期一161．繪出典型的細(xì)胞融合過程圖。2．計(jì)算細(xì)胞融合頻率。3．說明影響原生質(zhì)體融合的因素。七、作業(yè)2021/3/29星期一17

本實(shí)驗(yàn)所用PEG融合方法不能直接用于未脫壁植物細(xì)胞的融合，因?yàn)橹参锛?xì)胞具有細(xì)胞壁，PEG無法介導(dǎo)其細(xì)胞融合；但是，如果將植物細(xì)胞進(jìn)行脫壁處理后，則可使用PEG融合方法進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn)。

影響原生質(zhì)體融合的因素。（1）首先是酶解條件：滲透壓穩(wěn)定劑

Ca2+

、Mg2+、蔗糖可保持原生質(zhì)體穩(wěn)定利于再生；隨著酶解時間的增加原生質(zhì)體的釋放量增大；酶解濃度到達(dá)一定濃度后，原生質(zhì)體的再生率下降；再就是酶解溫