(高清版)GBT 40626-2021 楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌檢疫鑒定方法

楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌檢疫鑒定方法2021-10-11發(fā)布I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC271)提出并歸口。1楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌檢疫鑒定方法本文件描述了楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌的癥狀檢查、分離培養(yǎng)、生化特征測(cè)定和分子鑒定的方法。本文件適用于進(jìn)出境楊樹苗木等植物材料中攜帶楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌的檢疫、檢測(cè)和鑒定，以及田間調(diào)查和病害監(jiān)測(cè)工作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求SN/T2601植物病原細(xì)菌常規(guī)檢測(cè)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4病菌分類信息中文名：楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌AplanobacteriumpopuliRidéXanthomonaspopulisubsp.populi分類地位：變形菌門(Proteobacteria),變形菌綱(Gammaproteobacteria),黃單胞菌目(Xan-thomonadaceae),黃單胞菌科(Xanthomonadaceae),黃單胞菌屬(Xanthomonas)。楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌的相關(guān)資料參見附錄A。5方法原理?xiàng)顦浼?xì)菌性潰瘍病菌的危害癥狀、菌落形態(tài)特征、煙草過敏性反應(yīng)、生理生化特性，分子生物學(xué)特性以及致病性測(cè)試是本文件檢疫鑒定方法的原理。6檢測(cè)流程檢測(cè)流程見圖1。2待測(cè)樣品待測(cè)樣品癥狀觀察菌落形態(tài)觀察并挑取可疑菌落革蘭氏染色、鞭毛染色(初篩)煙草過敏性反應(yīng)、生化特征測(cè)定(初篩)分子特異性檢測(cè)致病性測(cè)試按以上實(shí)驗(yàn)步驟順序，若分子特異性檢測(cè)陰性則判定為未檢山楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌按以上實(shí)驗(yàn)步驟順序，若分子特異性檢測(cè)和致病性測(cè)試為陽性則判定為檢出楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌圖1檢測(cè)流程7儀器及用具電子天平(分度值：1/10000g)、恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、掌上離心機(jī)、純水儀、生物顯微鏡、高壓滅菌器、聚合酶鏈反應(yīng)核酸擴(kuò)增儀(PCR儀)、電泳儀、凝膠成像儀、超低溫冰箱、紫外分光光度計(jì)、8主要試劑及培養(yǎng)基8.1試劑和材料除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，所有試驗(yàn)用水均為滅菌蒸餾水。(MgSO?·7H?O)、磷酸氫二鉀(K?HPO?)、溴酚藍(lán)(CgH?Br?O;S)、七葉靈(CisH?O?)、檸檬酸鐵3(FeC?H?O?)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、冰醋酸(C?H?O?)、氯化鎂(MgCl?)、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、DNA聚合酶(Taq酶),氧化酶試紙條、細(xì)菌微量生化鑒定管、溴化乙錠(C??H20N3Br)、瓊脂蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(NDA)配制按照附錄B操作。9檢疫鑒定方法9.1癥狀觀察楊樹的病害調(diào)查或進(jìn)出境楊樹苗木的現(xiàn)場(chǎng)檢疫中，若發(fā)現(xiàn)枝條皮層產(chǎn)生裂縫，從裂縫中流出灰褐色細(xì)菌菌液，或樹干出現(xiàn)腫大的、瘤狀潰瘍斑(見A.2危害情況),取樣帶回實(shí)驗(yàn)室做進(jìn)一步分離鑒定。9.2寄主組織分離培養(yǎng)按照SN/T2601要求進(jìn)行操作。取疑似潰瘍病癥狀的樹段進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，表面用75%酒精消毒后，去除樹皮，把內(nèi)部變色木材切成長(zhǎng)度和厚度3mm～4mm的小塊，用無菌水清洗三次。在滅菌離心管中加入少量無菌水，將小塊病組織放入無菌水中，并用滅菌研磨棒對(duì)小塊病組織進(jìn)行碾壓研磨，10min后用加樣槍吸取80μL病組織浸出液，在蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基或NDA培養(yǎng)基平板上涂布分離，做不少于5個(gè)平板。平板置于25℃下培養(yǎng)4d～5d后觀察，若發(fā)現(xiàn)可疑菌落(特征為直徑3mm~4mm,圓形，輕微凸起，邊緣整齊，黃色奶油狀),則挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)染病苗木皮層裂縫流出菌液，可直接用接種環(huán)蘸取并在蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基或NDA培養(yǎng)基平板上劃線分離，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每份樣品做不少于5個(gè)平板，培養(yǎng)4d～5d后挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。9.3分離菌的鑒定9.3.1革蘭氏染色反應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)，要設(shè)置陽性菌的對(duì)照。若染色結(jié)果為革蘭氏陰性菌，應(yīng)進(jìn)行鞭毛染色試驗(yàn)。革蘭氏染色應(yīng)采用3%氫氧化鉀(KOH)溶液進(jìn)行檢測(cè)判斷。用牙簽挑取新鮮待測(cè)菌落放在載玻片上，與1滴氫氧化鉀溶液混勻，30s后用牙簽慢慢拉出，有拉絲現(xiàn)象的為革蘭氏陰性菌，無拉絲現(xiàn)象為革蘭氏陽性菌。9.3.2鞭毛染色反應(yīng)若分離菌經(jīng)生物顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有鞭毛并且鞭毛極生，繼續(xù)進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測(cè)。9.3.3煙草過敏性反應(yīng)取分離的菌株用無菌水配制成約10?CFU/mL菌懸液，用滅菌注射器接種煙草葉片背面，置于25℃光照培養(yǎng)，24h～48h觀察煙草葉片是否出現(xiàn)過敏性壞死反應(yīng)。若葉片出現(xiàn)枯斑情況則為陽性反應(yīng)，若出現(xiàn)黃斑或不明顯變化則為陰性反應(yīng)。同時(shí)接種陽性菌株懸液和無菌水分別作為陽性對(duì)照和空白對(duì)照。采用微量生化鑒定管對(duì)可疑菌株和楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)，該步驟也可4使用細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)等自動(dòng)化生化指標(biāo)檢測(cè)設(shè)備。楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌的生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果若為七葉靈水解陰性，明膠液化陰性，D-木糖、蜜二糖、棉子糖不產(chǎn)酸，能從甘露糖、半乳糖和果糖產(chǎn)酸，則繼續(xù)進(jìn)行分子方法鑒定步驟。生化指標(biāo)測(cè)定方法按照附錄B操作。9.3.5分子特異性檢測(cè)采用試劑盒提取細(xì)菌DNA。按照SN/T1193要求進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)的操作。根據(jù)楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌RNA聚合酶σ-70因子的編碼基因(rpoD)設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增片段大小為160bp,檢測(cè)方法及步驟按照附錄C操作。采用楊樹感病品種的離體枝條，試驗(yàn)在控溫的室內(nèi)或培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度控制在20℃~25℃。將培養(yǎng)48h的供試菌株用無菌水配制成約10?CFU/mL菌懸液，將枝條截成約40cm長(zhǎng)的段，在枝條中部切割韌皮部形成傷口，用無菌紗布蘸取菌懸液放置于傷口上，并用保鮮膜包裹，起到保濕的作用，同時(shí)接種陽性菌株懸浮液和無菌水分別作為陽性對(duì)照和空白對(duì)照。5d后觀察傷口處情況，若發(fā)現(xiàn)韌皮部具有軟腐癥狀且有變色情況出現(xiàn)，且在發(fā)病組織處分離到供試菌株，則證明供試菌株對(duì)楊樹有致病性。10結(jié)果判定分離得到的細(xì)菌菌株經(jīng)過初篩試驗(yàn)(菌落形態(tài)、革蘭氏染色、鞭毛染色、煙草過敏性試驗(yàn)、生化特征測(cè)定)步驟檢測(cè)，若PCR特異性檢測(cè)為陰性，則判定未檢出楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌。若PCR特異性檢測(cè)為陽性，且致病性測(cè)試為陽性，則判定檢出楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌。11菌株保存與處理從檢測(cè)樣品中分離并鑒定為楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌的菌株，應(yīng)妥善保存。將菌株接種于營(yíng)養(yǎng)葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(NDA)斜面上，23℃培養(yǎng)1d后轉(zhuǎn)入4℃低溫冰箱中保存，定期(約30d)轉(zhuǎn)接防止病菌死12結(jié)果記錄與資料保存完整的實(shí)驗(yàn)記錄包括：樣品的種類、來源地、接樣(或采樣)時(shí)間、實(shí)驗(yàn)的時(shí)間、地點(diǎn)、方法和結(jié)果等，并要有實(shí)驗(yàn)人員和審核人員簽字記錄。5(資料性)楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌相關(guān)資料A.1寄主植物楊屬(Populus)、銀白楊(PopulusalbaL.)、大葉鉆天楊(PopulusbalsamiferaL.)、加拿大楊A(yù).2危害情況楊樹細(xì)菌性潰瘍病最早是于1934年在英國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的，隨后很快傳播至幾乎整個(gè)歐洲，一直是歐洲楊樹生產(chǎn)中普遍而嚴(yán)重的病害。該病害可嚴(yán)重削弱樹木生長(zhǎng)，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可造成樹木死亡，病樹死亡率一般可達(dá)12.0%～14.2%,感病樹種甚至可達(dá)37%。病樹主干的潰瘍斑使木材的加工利用價(jià)值大大降低。該病害還限制了某些栽培性狀優(yōu)良但感病嚴(yán)重的楊樹品種和無性系的發(fā)展。楊樹細(xì)菌性潰瘍病主要危害10年生大樹，幼樹少見，1～2年生幼苗不會(huì)發(fā)生此病，主要危害主干和主枝。在感染初期，使樹干形成橢圓形、光滑的小瘤，腫瘤增大成明顯后，其韌皮部和木質(zhì)部出現(xiàn)變色，夏季開裂流出棕褐色黏液，有臭味。病菌進(jìn)入樹體后，在寄主的細(xì)胞間隙擴(kuò)散，溶解細(xì)胞壁和中膠層，使細(xì)胞離解、崩潰，最終形成潰瘍斑，枝條皮層產(chǎn)生裂縫，從裂縫中流出灰褐色細(xì)菌菌液。樹木生長(zhǎng)旺盛期，在病斑周圍產(chǎn)生愈傷組織，包圍病斑。病斑發(fā)展越過愈傷組織，進(jìn)一步擴(kuò)大，如此反復(fù)多次在樹干出現(xiàn)腫大的、有縱裂的瘤狀潰瘍斑，剖開病部，可見其下的皮層變褐、腐爛，大型潰瘍斑下面木質(zhì)部的表面也往往變褐，病害發(fā)展到后期，形成增生的梭形瘤或長(zhǎng)圓柱形瘤，最終木材變色，中心腐爛，整個(gè)植株呈禿頂狀。病害主要由雨水、昆蟲等傳播，經(jīng)皮孔、傷口侵入危害，發(fā)病楊樹產(chǎn)生的黏液是重要的侵染源。A.3癥狀楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌引起的癥狀見圖A.1。圖A.1楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌危害癥狀6A.4形態(tài)特征單生，不產(chǎn)生聚β-羥基丁酸鹽顆粒，沒有鞘或附屬物。未知有休眠期。具單根極生鞭毛，以單極毛運(yùn)動(dòng)，嚴(yán)格好氧，以分子氧為終端電子受體。不能反硝化或硝酸鹽還原反應(yīng)。最適生長(zhǎng)溫度24℃~26℃。在含有葡萄糖的培養(yǎng)基上產(chǎn)生一種多糖黏液，即莢膜。在多種培養(yǎng)基上可產(chǎn)生黃色色素，色素是極具特征的溴化芳基多烯黃單胞菌素。A.5生化特性接觸酶試驗(yàn)陽性，氧化酶試驗(yàn)陰性，有機(jī)化能營(yíng)養(yǎng)，不還原硝酸鹽。能利用不同的糖和有機(jī)酸鹽作為唯一的碳源。可利用多種糖產(chǎn)生少量酸，石蕊牛奶中不能產(chǎn)酸，能使甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，不能液化明膠，可利用乳酸鈣而不能利用谷氨酰胺生長(zhǎng)，不能利用天門冬酰胺作為唯一的碳源和氮源。0.1%(通常為0.02%)氯化三苯四唑能抑制生長(zhǎng)。通常必需的生長(zhǎng)因子包括蛋氨酸、谷氨酸、核酸或其混合物。DNA的堿基(G+C)摩爾分?jǐn)?shù)為62.1%～65.6%。A.6分布情況楊樹細(xì)菌性潰瘍病是楊樹重要檢疫性細(xì)菌病害，主要危害楊樹枝干，產(chǎn)生潰瘍斑，降低木材品質(zhì)，導(dǎo)致樹木死亡。該病害在歐洲、北美、亞洲、大洋洲均有分布，在我國(guó)未見報(bào)道。A.7傳播途徑病菌潰瘍斑內(nèi)越冬，春季病斑內(nèi)細(xì)菌開始活動(dòng)，細(xì)菌溢流出樹皮外，借風(fēng)雨、流水、昆蟲和人為活動(dòng)傳播，遠(yuǎn)距離傳播主要是帶菌苗木、接穗等。昆蟲能攜帶病菌，在傳病過程中也起了重要作用。人工接種病菌的蚜蟲和其他昆蟲的傳病試驗(yàn)已得到證實(shí)。從蛀蟲(Cypsonomaaceriana)的蟲癭上和取食幼樹的白楊透翅蛾(Sciapterontabaniformis)的消化道里及排出的糞便上均檢查出該病菌，因而推斷，這些昆蟲很可能是傳病的媒介，而土壤可能是病菌的自然棲息場(chǎng)所。A.8種以下階元分類目前楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌[Xanthomonaspopuli(exRidé1958)Ridé&.Ridé1992]存在兩個(gè)亞種，即Xanthomonaspopulisubsp.populi和Xanthomonaspopulisubsp.salicis,其中后者是1977年M.DeKam在荷蘭的一種柳樹(Salixdasyclada)上發(fā)現(xiàn)的病原菌，根據(jù)國(guó)際細(xì)菌命名法規(guī)，作為一個(gè)亞種并入楊樹細(xì)菌性潰瘍病菌(Xanthomonaspopuli),兩個(gè)亞種可以通過寄主植物、菌落形態(tài)、有無運(yùn)動(dòng)性、耐鹽性高低及生化指標(biāo)等加以區(qū)分。(規(guī)范性)培養(yǎng)基的配制和生化指標(biāo)測(cè)定方法B.1培養(yǎng)基B.1.1蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基蛋白胨5g,硫酸鎂0.25g,蔗糖20g,磷酸氫二鉀0.5g,瓊脂粉18g,蒸餾水1000mL。調(diào)整pH值至7.2～7.4,121℃濕熱滅菌15min。B.1.2營(yíng)養(yǎng)葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(NDA)牛肉浸膏3g,蛋白胨5g,酵母膏2g,葡萄糖10g,氯化鈉5g,瓊脂粉18g,蒸餾水1000mL。調(diào)整pH值至7.2～7.4,121℃濕熱滅菌15min。B.1.3營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)牛肉浸膏3g,蛋白胨10g,氯化鈉5g,瓊脂粉18g,蒸餾水1000mL。調(diào)整pH值至7.2～7.4,121℃濕熱滅菌15min。B.1.4休和利夫森二氏培養(yǎng)基蛋白胨2g,氯化鈉5g,葡萄糖10g,磷酸氫二鉀0.2g,瓊脂粉6g,溴酚藍(lán)(先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)3mL,蒸餾水1000mL