牦牛弓形蟲病診斷技術(shù)

1牦牛弓形蟲病診斷技術(shù)本文件適用于牦牛弓形蟲病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查NY/T573-2022NY/T541-20163.1弓形蟲Toxoplasmagondii腹瀉、呼吸困難和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等，剖檢以3.2牦牛弓形蟲病yaktoxoplas4縮略語PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReactioELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-LinkedImmuPBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphate-BufferedSalin25.2初步判定無菌采集疑似患病動物（或死亡動物）的淋巴結(jié)穿刺液、血液、腹水或羊水等體液0.5mL~1mL或?qū)⒉杉瘶悠吩?4h內(nèi)送往實驗室進行檢測，采樣應(yīng)符合NY/T541-23附錄B.3）、1%瓊脂糖凝膠（見附錄B.4）、Go以弓形蟲529bp重復(fù)序列為靶基因（見附錄C）。上游引物：5’-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3’下游引物：5’-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3’根據(jù)全血/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒說明書，提取樣品組織基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模9.1設(shè)備和器材9.2試劑和材料PBST洗滌液（見附錄B.6）、封閉液（見附錄B.7）、TMB顯色液、終止9.3操作方法9.3.1樣品處理4取無菌采集的牦牛血液約1mL，斜放于4℃靜置5h后，置室溫待血清析出，1000g離心10min分離9.3.2.1抗原包被9.3.2.2洗滌9.3.2.3封閉9.3.2.4待檢血清洗滌3次。將待檢血清用樣品稀釋液作1:20稀釋后，每孔100μL，同時做陰性、陽性血清和空白對9.3.2.5酶標抗體9.3.2.7終止反應(yīng)9.3.2.8讀數(shù)9.3.3結(jié)果判定在陰性血清對照孔和空白對照孔OD<0.15、陽性血清對照孔OD≥0.4時，按如下條件進行結(jié)果判被檢血清孔OD平均值≥0.2，且被檢血清孔OD56取姬姆薩粉0.5g，甘油25mL混勻，60°C水浴加熱2h，其間不斷攪拌混勻。冷卻至室溫后加入甲醇NaCl8.5g，Na2HPO41.1g，NaH2），），7CTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTGTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTGTTTTTCTGATTTTTGACTCGGGCCCAGCTGCGTCTGTCGGGATGAGACCGCGGAGCCGAAGTGCGTTTTCTTTGACTTTTTTTTGTTTTTTCACAGGCAAGCTCGCCTGTGCTTGGAGCCACAGAAGGGACAGGAAGGGGACTACAGACGCGATGCCGCTCCTCCAGCCGTCTTGGAGGAGAGATATCAGGGATGAAGGCGAGGGTGAGGATGAGGGGGTGGCGTGGTTGGGAAGCGACGAGAGTCGGAGAAGAAGATGTTTCCGGCTTCCCTGCTTTTCCTGGAGGGTGGAAAAAGAGACACCGGAATGCAGACGAGACGACGCTTTCCTCGTGGTGATGGCGGAGAGAATTGAAGAGTGGAGAAGAGGGGAGACAGAGTCGGAGGCTTGGACGAAGGGAGGAGGAGGGGTAGGAGAGGAATCCAGA89PCR儀、高速冷凍離心機、細胞破碎儀、恒溫搖床、核酸、蛋白電泳裝置、紫外分光光度計、蛋白引物ExpSAG1-F/ExpSAG1-R（10μMBamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶，T4DNA連膠DNA回收試劑盒，克隆載體pETASYTM-T1，表達載體pET-28a，感受態(tài)大腸桿菌DH5α,感受態(tài)大腸His標簽蛋白純化試劑盒，LB培養(yǎng)基，一次性針頭濾器（孔徑0.45μm），蛋白濃縮管。SAG1ExpSAG1-FExpSAG1-R5’-CGgaattcTCGGATCCCCCTCTTGTTGCCAATC-3’5’-CCGctcgagTTAAGCCGATTTTGCTGACCCTG-3’EcoRIXhoIEcoRI、1μLXhoI，6μLddH2O，37℃酶切30~60min。E.5.1取陽性表達菌Transseta，按1:100的比例接種到含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃180rpm/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.4~0.E.5.2將誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液分裝到離心管中，在4℃下8000rpm離心10min，棄上清液。E.5.4將破碎菌體裂解物在4℃以1E.5.6將透析后的蛋白轉(zhuǎn)入蛋白濃縮管，于4℃40濃縮管中蛋白濃度大于1mg/mL時停止離心。E.5.7濃縮的重組蛋白分裝于1.5[1]Robert-GangneuxF,DardéML.Epidemiologyofanddiagnosticstrategiesfortoxoplasmosis[J].ClinMicrobiolRev,2012,25(2):264-9[2]HillD,DubeyJP.Toxoplasmagondii:transmission,diagnosisandprevention[J].ClinMicrobiolInfect,2002,8(10):634-640.[3]FilisettiD,GorciiM,Pernot-MarinoE,etal.Diagnosisofcongenitaltoxoplasmosis:comparisonoftargetsfordetectionofToxoplasmagondiibyPCR[J].JClinMicr