GB/T 18642-2021 旋毛蟲診斷技術(shù)

代替GB/T18642—2002旋毛蟲診斷技術(shù)DiagnostictechniquesforTrichinellaspp.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14縮略語(yǔ) 15壓片鏡檢法 26集樣消化法 37酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA法) 48熒光免疫層析試紙卡法 7 9 附錄A(規(guī)范性附錄)壓片鏡檢法溶液配制及判定示意圖 附錄B(規(guī)范性附錄)消化液配制 附錄C(資料性附錄)旋毛蟲集樣消化法流程圖 附錄D(規(guī)范性附錄)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用溶液配制 附錄E(規(guī)范性附錄)熒光免疫層析試紙卡試驗(yàn)用溶液配制 附錄F(資料性附錄)熒光免疫層析試紙卡結(jié)構(gòu)及判定示意圖 附錄G(規(guī)范性附錄)多重PCR法用溶液配制 ⅢGB/T18642—2021本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T18642—2002《豬旋毛蟲病診斷技術(shù)》,與GB/T18642—2002相比，除編輯性修改外主要技術(shù)變化如下：——增加了規(guī)范性引用文件(見(jiàn)第2章);-——增加了術(shù)語(yǔ)和定義(見(jiàn)第3章);——增加了縮略語(yǔ)(見(jiàn)第4章);——增加了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)診斷方法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用溶液的配制(見(jiàn)第7章、附——增加了熒光免疫層析試紙卡診斷方法、熒光免疫層析試紙卡試驗(yàn)用溶液配制、熒光免疫層析試紙卡結(jié)構(gòu)及判定示意圖(見(jiàn)第8章、附錄E和附錄F);——增加了用于旋毛蟲蟲種鑒定的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(多重PCR)診斷方法、多重PCR法用溶液配制(見(jiàn)第9章、附錄G);——增加了綜合判定(見(jiàn)第10章);--——增加了壓片鏡檢法溶液配制及判定示意圖(見(jiàn)附錄A)——增加了消化液的配制(見(jiàn)附錄B);——增加了旋毛蟲集樣消化法流程圖(見(jiàn)附錄C)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林大學(xué)、中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：GB/T18642—2021旋毛蟲(Trichinellaspp.)由英國(guó)學(xué)者JamesPanesPaget于1835年首次在倫敦一人尸體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，同年RichardOwen把該病原定名為Trichinellaspiralis。目前，旋毛蟲經(jīng)種屬鑒定已發(fā)現(xiàn)9個(gè)種及3個(gè)尚未明確的基因型。旋毛蟲是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，可感染人和150多種動(dòng)物，主要通過(guò)生食或半生食寄生有活旋毛蟲的肉類(如豬肉、馬肉、犬肉及野生動(dòng)物肉等)而引發(fā)。人旋毛蟲病(HumanTrichinellosis)的潛伏期長(zhǎng)達(dá)2周～4周，死亡率2%～30%。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織疫病。本標(biāo)準(zhǔn)的修訂參考了OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》2017版(ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals,2017)、國(guó)際旋毛蟲病委員會(huì)(InternationalCommissiononTrichinellosis,ICT)《血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物和人體旋毛蟲感染的建議》2018版(Recommendationson theuseofserologicaltestsforthedetectionofTrichinellainfectioninanimalsandhumans,2018)和《旋毛蟲肌幼蟲基因分型建議》2018版(RecommendationsforgenotypingTrichinellamusclestagelar- vae,2018)相關(guān)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。血清學(xué)診斷增加了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和熒光免疫層析試紙卡兩種技術(shù)，血清學(xué)診斷技術(shù)判定為旋毛蟲感染陽(yáng)性或疑似陽(yáng)性的樣本可進(jìn)一步通過(guò)消化法確證；分子生物學(xué)診斷增加了多重聚合酶鏈反應(yīng)(多重PCR)技術(shù)。1GB/T18642—2021旋毛蟲診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了家畜(豬、馬和犬屬動(dòng)物)和野生動(dòng)物旋毛蟲病原學(xué)診斷、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)——多重PCR方法適用于旋毛蟲分離株種屬及基因型的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3.13.4旋毛蟲通過(guò)表皮分泌或通過(guò)消化道排出的各種分子產(chǎn)物。寄生于宿主肌細(xì)胞時(shí)期的旋毛蟲幼蟲。DMEM:杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedEaglemedium)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay)2GB/T18642—2021HEPES:4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid]IL-ESP:腸道期幼蟲排泄分泌物(intestinallarvae-excretory/secretoryproducts)MES:2-嗎啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonicacid)ML-ESP:肌幼蟲排泄分泌物(musclelarvae-excretory/secretoryproducts)NHS:N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide)PBS:磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsalinebuffer)SD:標(biāo)準(zhǔn)差(standarddeviation)5壓片鏡檢法5.1.3夾壓玻璃板。5.2.2本標(biāo)準(zhǔn)所有試驗(yàn)用水均應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)。剝離脂肪和結(jié)締組織，用剪刀順肌纖維方向，按隨機(jī)采樣的要求，從樣本上至少剪取28粒燕麥粒(2mm×10mm)大小的肉樣，將肉樣均勻地放置在夾壓玻璃板上，排成一排，每個(gè)夾壓玻璃板可放置16粒。將制好的壓片放在低倍顯微鏡下(放大倍數(shù)4×10),從壓片一端邊沿開始觀察，直到另一端為止。不清晰處，可在10×10的放大倍數(shù)下進(jìn)一步觀察。5.4.1肌細(xì)胞內(nèi)有圓形或橢圓形包囊，且包囊中央有蜷曲的蟲體，判定為形成包囊的旋毛蟲。旋毛蟲包囊鏡下判定示意圖見(jiàn)圖A.1。5.4.2肌細(xì)胞內(nèi)有呈直桿狀或略蜷曲狀態(tài)蟲體，判定為無(wú)包囊的旋毛蟲。無(wú)包囊旋毛蟲鏡下判定示意圖見(jiàn)圖A.2。3GB/T18642—20215.4.4發(fā)現(xiàn)形成包囊的旋毛蟲和無(wú)包囊的旋毛蟲均判定為旋毛蟲感染。6.1.4分液漏斗。6.1.7電動(dòng)刀式絞肉機(jī)或碎肉機(jī)(孔徑≤3mm)。6.1.10恒溫培養(yǎng)箱。6.1.12培養(yǎng)皿(帶標(biāo)尺)。6.2試劑6.3操作流程操作流程見(jiàn)附錄C的圖C.1。宿主種類主要選擇的肌肉檢測(cè)質(zhì)量/g豬膈肌、舌肌馬咬肌、舌肌犬膈肌、咬肌、舌肌野豬膈肌、腓腸肌、舌肌熊膈肌、咬肌、舌肌海洋哺乳動(dòng)物(海豹、海象)膈肌、舌肌、鰭肌鱷魚咬肌、肋間肌其他野生肉食動(dòng)物舌肌、腓腸肌4GB/T18642—2021每只動(dòng)物可采集100g肌肉組織樣本，或?qū)?shù)只動(dòng)物肌肉樣本混合為100g(混合動(dòng)物數(shù)量≤30個(gè))。剝離脂肪和結(jié)締組織，與100g肉樣同等體積的鹽酸水溶液(B.1)混合，用刀式電動(dòng)絞肉機(jī)短時(shí)間(5s～10s)絞碎10次～20次或用碎肉機(jī)攪碎，至樣本無(wú)可見(jiàn)細(xì)碎塊為止。6.4.3.1將攪碎樣本取出，放入3L燒杯中，用預(yù)熱的45℃±2℃消化液沖洗絞肉機(jī)或碎肉機(jī)中殘留樣本，并用預(yù)熱的消化液補(bǔ)足至2L(即每克樣本加入20mL消化液)。6.4.3.2用錫箔紙覆蓋燒杯防止溶液飛濺，置于加熱磁力攪拌器上(燒杯內(nèi)放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子),或置于普通攪拌器并將攪拌器放入45℃±2℃恒溫培養(yǎng)箱中，持續(xù)加熱攪拌30min～60min(可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)延長(zhǎng)或縮減時(shí)間),至消化液中無(wú)肉眼可見(jiàn)碎肉為止。6.4.4.1取不銹鋼篩網(wǎng)(篩孔直徑180μm),放置于漏斗上方，漏斗下方接一分液漏斗，消化完成后5min內(nèi)將樣本混懸液倒入篩網(wǎng)。6.4.4.2過(guò)濾后的燒杯和篩網(wǎng)用至少100mL的溫水(37℃)沖洗，以確保篩網(wǎng)上沒(méi)有蟲體殘留(允許存留少量不易消化的脂肪和結(jié)締組織)。6.4.4.3若篩網(wǎng)上有碎肉殘?jiān)?，則需將碎肉殘?jiān)匦孪?.4.5.1將濾液在分離漏斗中沉淀30min,使旋毛蟲沉到底部，此時(shí)完全開啟漏斗開關(guān)，將底部混懸液(約40mL)移入50mL的離心管中。6.4.5.2將離心管中的混懸液靜置10min,棄去部分上清液，保留10mL底部混懸液。6.4.5.3如底部混懸液仍較為混濁，則向底部混懸液中加入30mL溫水(37℃),重復(fù)6.3.5.2,直至底部混懸液清澈。將濾清的沉淀物倒入有標(biāo)尺的培養(yǎng)皿中，在倒置顯微鏡(放大倍數(shù)4×10或10×10)下觀察有無(wú)蟲體和鈣化包囊。6.5結(jié)果判定結(jié)果判定如下：——顯微鏡下發(fā)現(xiàn)旋毛蟲或鈣化包囊，可確診為旋毛蟲感染?！旌蠘颖緸殛?yáng)性時(shí)，需對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行單獨(dú)消化鏡檢，以最終確定感染動(dòng)物個(gè)體。7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA法)5GB/T18642—20217.1.2不銹鋼篩網(wǎng)(篩孔直徑180μm)。7.1.3漏斗。7.1.4分液漏斗。7.1.5燒杯(1L和5L)。7.1.6離心管(15mL和50mL)。7.1.7注射器(10mL)。7.1.8電動(dòng)刀式絞肉機(jī)或碎肉機(jī)(孔徑≤3mm)。7.1.9溫度計(jì)。7.1.10磁力攪拌器和轉(zhuǎn)子。7.1.11恒溫培養(yǎng)箱。7.1.12顯微鏡。7.1.13一次性針頭濾器(0.22μm)。7.1.14細(xì)胞培養(yǎng)箱。7.1.15超濾管或透析袋(截留分子質(zhì)量5000Da)。7.1.16酶標(biāo)板(48孔或96孔)。7.1.17微量可調(diào)移液器(2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同規(guī)格)。7.1.18培養(yǎng)皿(帶篩網(wǎng)，網(wǎng)孔直徑180μm)。7.2.1培養(yǎng)液，見(jiàn)附錄D的D.1。7.2.2青霉素、鏈霉素。7.2.30.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS),見(jiàn)D.2。7.2.4包被緩沖液：超純水。7.2.5洗滌緩沖液，見(jiàn)D.3。7.2.6過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物，見(jiàn)D.4。7.2.7顯色液，見(jiàn)D.5。7.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，體重200g±20g。7.4操作方法7.4.1旋毛蟲收集將人工感染旋毛蟲的Wistar大鼠去除皮膚、內(nèi)臟、脂肪和結(jié)締組織后，按照6.4.2～6.4.5所列方法，收集旋毛蟲肌幼蟲。7.4.2旋毛蟲抗原制備7.4.2.1旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌物(ML-ESP)抗原制備7.4.2.1.1將收集的旋毛蟲肌幼蟲用含有青霉素(500U/mL)和鏈霉素(500U/mL)的培養(yǎng)液洗滌三次(每次靜置20min)。7.4.2.1.2將其放入含青霉素(250U/mL)和鏈霉素(250U/mL)的培養(yǎng)液中(密度為5000條/mL),37℃,10%二氧化碳，培養(yǎng)18h,收集上清液。6GB/T18642—20217.4.2.1.3用一次性針頭過(guò)濾器濾掉殘留的肌幼蟲及碎片后，用PBS通過(guò)超濾管或透析袋透析，去除分子質(zhì)量小于3000Da的蛋白，將回收得到的旋毛蟲ML-ESP抗原(終濃度為1000μg/mL,吸光度280/260>0.1)保存于—70℃?zhèn)溆谩?.4.2.1.4培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)保證培養(yǎng)基未被細(xì)菌、真菌等污染。7.4.2.1.5具體可參見(jiàn)ICT《旋毛蟲血清學(xué)診斷方法》(2018版)。7.4.2.2.1將收集的旋毛蟲肌幼蟲經(jīng)口感染W(wǎng)istar大鼠(8000條/只),6h后將大鼠處死，并立即取出的培養(yǎng)液洗滌3次，每次洗滌后2000g離心10min。將收集到的蟲體按照7.4.2.1.2～7.4.2.1.4所列用包被緩沖液分別將旋毛蟲ML-ESP及IL-ESP抗原稀釋至濃度為10μg/mL,將兩種抗原按1:1比。封板膜密封后置入37℃恒溫箱孵育60min或者4℃恒溫箱過(guò)夜。揭掉封板膜，棄去孔內(nèi)包被液，在吸水紙上拍干或吹風(fēng)筒吹干。每孔加滿洗滌緩沖液，靜置30s后7.4.5.2用洗滌緩沖液將待測(cè)血清稀釋至工作濃度(1:50),加入待測(cè)樣本孔中，每孔100pL;陽(yáng)性血清和陰性血清按照同樣比例稀釋至工作濃度并分別加入陽(yáng)性和陰性對(duì)照孔，加樣量均為100μL;空白7.4.5.3用封板膜密封后放置室溫孵育30min。陰性對(duì)照血清和陽(yáng)性對(duì)照血清來(lái)源見(jiàn)D.7。7.4.6加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物類的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物。7.4.6.2用洗滌緩沖液將抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物稀釋至工作濃度(1:5000～1:10000或按照試劑的操作說(shuō)明),每孔加入100μL,放置室溫孵育30min。加入終止液后10min內(nèi)，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)450nm處的光吸收值(OD?50值)。GB/T18642—2021若空白對(duì)照孔OD值小于0.1,陽(yáng)性參考血清OD值在1.0±2SD范圍，且P/N值大于4,則試驗(yàn)成待測(cè)樣本的P/N值≥4,判定該樣本為旋毛蟲感染陽(yáng)性血清；若3≤P/N值<4,則判定該樣本為疑似旋毛蟲感染血清。8熒光免疫層析試紙卡法8.1.4pH計(jì)。8.1.7超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)。8.1.8水平搖床。8.1.10微量可調(diào)移液器(2.5pL、10μL、100μL、200uL、1000μL等不同規(guī)格)8.2.1時(shí)間分辨熒光微球(1%,避光)。8.2.2山羊抗豬IgG。8.2.3兔抗山羊IgG。8.2.6玻璃纖維素膜。8.2.7吸水紙。8.2.11N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。78GB/T18642—2021方法同7.4.2,用0.01mol/LPBS緩沖液分別將旋毛蟲ML-ESP及IL-ESP抗原稀釋至2mg/mL,將兩種抗原按1:1比例充分混合(工作濃度均為1mg/mL)。8.3.2.3加入40μL的5mg/mL山羊抗豬IgG(0.01mol/LPBS緩沖液稀釋),室溫孵育1h。8.3.2.54℃,8100g離心15min,棄上清液。8.3.2.74℃超聲分散1mi將含有偶聯(lián)抗體的熒光微球用試紙噴膜儀噴涂至300mm×5mm玻璃纖維素膜上，噴涂量為50μL/cm,4℃真空抽干，于4℃干燥保存?zhèn)溆谩?.3.3.2.1用濃度為1mg/mL旋毛蟲ES混合抗原和0.625mg/mL兔抗山羊IgG(0.01mol/LPBS緩沖液稀釋)分別作為檢測(cè)線和對(duì)照線試劑。8.3.3.2.2用試紙噴膜儀將兩種試劑分別點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，點(diǎn)樣量為1pL/cm。37℃干燥2h,4℃密封保存?zhèn)溆?。條切割機(jī)將其切成3.5mm寬的試紙條，將試紙條放入試紙卡中，將試紙卡放入含有干燥劑的密封袋8.4.2將試紙卡平放于操作臺(tái)面，加樣孔朝上，向加樣孔中加入100μL稀釋后的血清樣本，室溫靜置8.5試驗(yàn)成立條件結(jié)果判定應(yīng)在加樣后20min內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)成立條件如下：——若陽(yáng)性血清樣本的對(duì)照線和檢測(cè)線均顯色，陰性血清僅對(duì)照線顯色而檢測(cè)線不顯色，則試驗(yàn)成立；9GB/T18642—2021——熒光免疫層析試紙卡檢測(cè)結(jié)果判定示意圖見(jiàn)附錄F的圖F.2。9多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(多重PCR法)9.1.3穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽。9.1.4凝膠成像儀(或紫外透射儀)。9.1.6無(wú)核酸酶水處理的離心管與吸頭。9.1.7PCR擴(kuò)增管。下列5條引物為上游引物：——5'-GTTCCATGTGAACAGCAGT-3';——5'-GCTACATCCTTTTGATCTGTT-3';——5'-GCGGAAGGATCATTATCGTGTA-3';——5'-GTGAGCGTAATAAAGGTGCAG-3';——5'-CAATTGAAAACCGCTTAGCGTGTTT-3'。下列5條引物為下游引物：——5'-CGAAAACATACGACAACTGC-3';—-——5'-AGACACAATATCAACCACAGTACA-3';——5'-TGGATTACAAAGAAAACCATCACT-3'; 5'-TTCATCACACATCTTCCACTA-3':———5'-TGATCTGAGGTCGACATTTCC-3'。合工作液。GB/T18642—20219.3試劑9.3.1PCR試劑9.3.1.3MgCl?:25mmol/L。9.3.2.1電泳緩沖液：50×TAE貯存液(見(jiàn)附錄G的G.1),臨用時(shí)加蒸餾水配成1×TAE緩沖液(配方9.3.2.4DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：分子大小范圍100bp～500bp,50bp梯度。9.4.2用T.spiralis蟲體作為陽(yáng)性樣本。9.4.3用未感染旋毛蟲的豬或其他動(dòng)物的肌肉作為陰性樣本。9.5.1DNA提取使用經(jīng)驗(yàn)證的商品化DNA提取試劑盒提取DNA。10×PCR緩沖液dNTP(2.5mmol/L)MgCl?(25mmol/L)1pL下游引物混合工作液(10μmol/L)DNA模板雙蒸水補(bǔ)足至25mL具體可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[3]。第二階段，95℃變性10s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；9.6擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)9.6.12%瓊脂糖凝膠板的制備稱取2g瓊脂糖，加入100mL1×TAE緩沖液中。加熱融化后加5pL(10mg/mL)溴乙錠，混勻后倒入放置在水平臺(tái)面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依據(jù)樣本數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔),放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒(méi)膠面。取10μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2pL加樣緩沖液混勻后加入一個(gè)加樣孔。每次電泳同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。電壓110V～130V或電流80mA～100mA,電泳30min～40min。9.7試驗(yàn)成立條件陽(yáng)性對(duì)照樣本有一條173bp擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照沒(méi)有條帶或僅有引物二聚體條帶，則試驗(yàn)成立，結(jié)果有效。9.8結(jié)果判定9.8.1擴(kuò)增條帶分析不同大小擴(kuò)增條帶判定結(jié)果如下：-——待測(cè)樣本有一條173bp的擴(kuò)增條帶，可判定該旋毛蟲蟲種為T.spiralis(T1);——待測(cè)樣本有一條129bp的擴(kuò)增條帶，可判定該旋毛蟲蟲種為T.nativa(T2);——待測(cè)樣本有兩條擴(kuò)增條帶，分別為129bp和253bp,可判定該旋毛蟲蟲種為T.britovi(T3)-—待測(cè)樣本在292bp～360bp之間有1～3條擴(kuò)增條帶，可判定該旋毛蟲蟲種為T.pseudospir-alis(T4);——待測(cè)樣本有兩條擴(kuò)增條帶，分別為129bp和316bp,可判定該旋毛蟲蟲種為T.murrelli(T5);———待測(cè)樣本有兩條擴(kuò)增條帶，分別為129bp和210bp,可判定該旋毛蟲蟲種為T6;——待測(cè)樣本有兩條擴(kuò)增條帶，分別為135bp和253bp,可判定該旋毛蟲蟲種為T9;——待測(cè)樣本有一條240bp的擴(kuò)增條帶，可判定該旋毛蟲蟲種為T.papuae(T10);9.8.2序列分析9.8.2.1T.britovi(T3)、T8和T9擴(kuò)增條帶相近，可通過(guò)測(cè)序比對(duì)分析，確定蟲種或基因型。序列分析如下：GB/T18642—2021T3GTTCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGTCAGTCGATCCTAAGAAAACGGCGAAAGCTTGTTCGAATTT70T8GTTCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGTCAGTCGATCCTAAGAAAACGGCGAAAGCTTGTTCGAATTT70T9GTTCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGTCAGTCGATCCTAAGAAAACGGCGAAAGCTTGTTCGAATTT70**********************************************************************T3GCGACATGAATTGTAAGACTGTGTGT TTATTGTGTGTGTGCAGTTGTCGTATGTTTTCG129T8GCGACATGAATTGTAAGACTGTGTGTGTTTATTGTGT GTGCAGTTGTCGTATGTTTTCG129T9GCCACATGAATTGTAAGACTGTGTGTGTTTATTGTGTGTGCCTGTGCAGTTGTCGTATGTITICG135*********************************************************9.8.2.2T.nativa(T2)和T.patagoniensis(T12)擴(kuò)增條帶相近，可通過(guò)測(cè)序比對(duì)分析，確定蟲種或基因型。序列分析如下：T2GGTTCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGTCAGTCGATCCTAAGAAAACGGCGAAAGCTTGTTCGAATT70T12GGITCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGICAGTCGATCCTAAGAAAACGGCGAAAGCTIGTTCGAATT70**********************************************************************T2TGCGACATGAATTGTAAGACTG1GTG--AATTGTGTGTGTGTGCAGITGTCGTATGTTITC129T12TGCGACATGAATTGTAAGACIGIGIGIGAATTGGGTGTGCAGITGTCGTATGTTITC127******************************************************10綜合判定10.1受檢動(dòng)物樣本經(jīng)壓片鏡檢法(第5章)和集樣消化法(第6章)任一項(xiàng)檢測(cè)出旋毛蟲蟲體或包囊10.2受檢動(dòng)物樣本經(jīng)ELISA法(第7章)和熒光免疫層析試紙卡法(第8章)任一項(xiàng)檢測(cè)出旋毛蟲特異抗體的，判定為該動(dòng)物血清旋毛蟲抗體陽(yáng)性，需進(jìn)一步通過(guò)集樣消化法(第6章)進(jìn)行確證。10.3經(jīng)多重PCR法(第9章)鑒定，可區(qū)分旋毛蟲不同種屬和基因型。GB/T18642—2021(規(guī)范性附錄)濃鹽酸(37%,密度1.179g/cm3)加雙蒸水至20mLA.2旋毛蟲包囊及無(wú)包囊旋毛蟲鏡下判定示意圖旋毛蟲包囊鏡下判定示意圖見(jiàn)圖A.1,無(wú)包囊旋毛蟲鏡下判定示意圖見(jiàn)圖A.2。圖A.1旋毛蟲包囊鏡下判定示意圖圖A.2無(wú)包囊旋毛蟲鏡下判定示意圖GB/T18642—2021(規(guī)范性附錄)消化液配制B.1鹽酸水溶液鹽酸(37%,密度1.179g/cm3)加雙蒸水至B.2消化液胃蛋白酶(1:10000NF/1:12500BP/1:2000FIP)鹽酸水溶液(B.1)消化液現(xiàn)用現(xiàn)配，用前預(yù)熱至45℃。2000mL2000mL(資料性附錄)旋毛蟲集樣消化法流程圖旋毛蟲集樣消化法流程圖見(jiàn)圖C.1。雙蒸水43℃~47℃20g(1:10000)10mL企部用于鏡檢40mi.圖C.1旋毛蟲集樣消化法流程圖(規(guī)范性附錄)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用溶液配制D.1培養(yǎng)液谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)液D.20.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)氯化鈉(NaCl)氯化鉀(KCl)調(diào)pH值至7.2。gggD.3洗滌緩沖液氯化鈉(NaCl)脫脂奶粉50g調(diào)pH值至7.4。D.4過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物(從試劑公司購(gòu)買)選擇使用相應(yīng)動(dòng)物種類的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白-酶結(jié)合物。D.5顯色液(TMB-過(guò)氧化氫尿素溶液)無(wú)水乙醇加雙蒸水至Na?HPO?檸檬酸GB/T18642—2021加雙蒸水至100mL調(diào)pH值至5.0～5.4。D.6終止液雙蒸水濃硫酸加雙蒸水至D.7陰性對(duì)照血清和陽(yáng)性對(duì)照血清200mL34mL300mL陰性對(duì)照血清和陽(yáng)性對(duì)照血清可從以下OIE認(rèn)證的旋毛蟲病協(xié)