微生物學(xué)檢驗基本技術(shù)

微生物學(xué)檢驗基本技術(shù)??！

1.葡萄糖代謝類型鑒別試驗(0/F或Hugh—Leifson,HL)

下層：蛋白陳1克氯化鈉0.5克

葡萄糖0.2克水100毫升1.6%浪甲酚紫(Bromocresolpurple)乙醇溶液0.1-0.2mL

PH=7.6注意：調(diào)完pH值后再加葡萄糖.

(1)原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加，稱為氧化型；能進(jìn)行無氧

降解的為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細(xì)菌為產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細(xì)菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都

能分解葡萄糖，而氧化型細(xì)菌在無氧環(huán)境中則不能分解葡萄糖。本試驗又稱氧化發(fā)醉

(0/F或Hugh—Leifson,HL)試驗，可用于區(qū)別細(xì)菌的代謝類型。

(2)方法：挑取少許純培養(yǎng)物(不要從選擇性平板中挑取)接種2支HL培養(yǎng)管中，在其

中一管加入高度至少為0.5cm的無菌液體石蠟以隔絕空氣(作為密封管)，另一管不加

(作為開放管)。置30℃孵箱孵育48h以上。

(3)結(jié)果：兩管培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸(顏色不變)為產(chǎn)堿型；兩管都產(chǎn)酸(變黃)為發(fā)酵

型；加液體石蠟管不產(chǎn)酸，不加液體石蠟管產(chǎn)酸為氧化型。

(4)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與其它非發(fā)酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細(xì)菌為發(fā)酵

型，非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌(發(fā)酵型)與微球菌(氧化

型)。

2.氧化酶試驗

(1)原理：氧化酚又稱細(xì)胞色素氧化的，是細(xì)胞色素氧化的系統(tǒng)中的最終呼吸酶。此醐

并不直接與氧化酶試劑起反應(yīng)，而是先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使

對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。因此，本試驗結(jié)果與細(xì)胞色素C的存在有關(guān)。

(2)方法：取潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加氧化酶試劑(10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水

溶液或10g/L鹽酸二甲基對苯二胺水溶液)1滴，Imin內(nèi)觀察結(jié)果。也可將試劑滴加到菌

落上進(jìn)行試驗。

(3)結(jié)果：陽性者立即變粉紅色，5-10s內(nèi)呈深紫色。無色為陰性。

(4)應(yīng)用：用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細(xì)菌均陽性。此外，也用于氣單胞菌和假單

胞菌屬與腸桿菌科細(xì)菌的區(qū)別，氣單胞菌和假單胞菌屬為陽性，而腸桿菌科細(xì)菌陰性。莫

拉菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等均為陽性。

注意事項：①試驗時應(yīng)避免接觸含鐵物質(zhì)，以免出現(xiàn)假陽性。②10g/L鹽酸四甲基對苯

二胺或10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液為無色溶液，在空氣中易被氧化而失效，故應(yīng)經(jīng)

常更換新試劑，并盛于棕色瓶中，若試劑已變成深藍(lán)色，應(yīng)棄去不用。

3.克氏雙糖鐵或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基試驗

雙糖鐵培養(yǎng)基

成份：

下層：蛋白陳1克氯化鈉0.5克

葡萄糖0.2克瓊脂0.3-0.5克

水100毫升

將上述物質(zhì)混勻調(diào)PH7.6后加1.2%酚紅0.4毫升

上層：蛋白陳1克氯化鈉0.5克

乳糖1克硫代硫酸鈉0.03克

硫酸亞鐵0.02克瓊脂1克

水100毫升

制法：1將下層配好，分裝中號試管(1毫升)，塞好包扎，15磅高壓滅菌半小時，使

凝固后備用。

2制上層時，先將蛋白月東水制好，加入硫酸亞鐵，硫代硫酸鈉，加熱溶解PH8.1,再加

入酚紅分瓶，(每瓶300毫升，稱取瓊脂包扎滅菌，趁熱加入乳糖隔水煮沸30分鐘或

112℃消毒15分鐘)。

3取已制的下層管，每管用無菌法倒入上層液約1。5毫升，邊斜放置使成斜面，凝固

后備用。

標(biāo)準(zhǔn)：無菌試驗合格，接種大腸桿菌下層產(chǎn)酸產(chǎn)氣，上層產(chǎn)酸。

試驗過程與意義

(1)原理：克氏雙糖鐵(KIA)或三糖鐵瓊脂(TSI)培養(yǎng)基制成高層和短的斜面，其中葡萄

糖含量僅為乳糖或蔗糖的十分之一，若細(xì)菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄

糖產(chǎn)酸使pH降低，因此斜面和底層均先呈黃色，但因葡萄糖量較少，所生成的少量酸可

因接觸空氣而氧化，并因細(xì)菌生長繁殖利用含氮物質(zhì)生成堿性化合物，使斜面部分又變成

紅色；底層由于處于缺氧狀態(tài)，細(xì)菌分解葡萄糖所生成的酸類一時不被氧化而仍保持黃

色。細(xì)菌分解葡萄糖、乳糖或蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使斜面與底層均呈黃色，且有氣泡。細(xì)菌產(chǎn)

生硫化氫時與培養(yǎng)基中的硫酸亞鐵作用，形成黑色的硫化鐵。

(2)方法：用接種針挑取待檢菌的菌落，先穿刺接種到KIA或TSI深層，距管底3~5min

為止，再從原路退回，在斜面上自下而上劃線，置35℃孵育1夕24h,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：常見的KIA反應(yīng)有如下幾種：①斜面堿性/底層堿性：不發(fā)酵碳水化合物,

系不發(fā)酵菌的特征。如銅綠假單胞菌。②斜面堿性/底層酸性：葡萄糖發(fā)酵、乳糖(和TSI

中的蔗糖)不發(fā)酵,是不發(fā)酵乳糖菌的特征，如志賀菌。③斜面堿性/底層酸性(黑

色)：葡萄糖發(fā)酵、乳糖不發(fā)酵并產(chǎn)生硫化氫，是產(chǎn)生硫化氫不發(fā)酵乳糖菌的特征。如沙

門菌、亞利桑那菌、枸椽酸桿菌和變形桿菌等。④斜面酸性/底層酸性：葡萄糖和乳糖

(和TSI中的蔗糖)發(fā)酵，是發(fā)酵乳糖的大腸菌群的特征，如大腸埃希菌、克雷伯菌屬和

腸桿菌屬。

(4)應(yīng)用：鑒別腸道桿菌用。KIA或TSI對初分離出的、可疑為革蘭陰性桿菌鑒定特別有

用。其反應(yīng)模式是許多桿菌鑒定表的組成部分，也可作為觀察其他培養(yǎng)基反應(yīng)的有價值的

質(zhì)控依據(jù)。

4.0/129試驗

(1)原理：0/129(2,4二氨基-6,7-二異丙基喋喔)能抑制弧菌屬、發(fā)光桿菌屬和鄰單

胞菌屬細(xì)菌生長，而氣單胞菌屬和假單胞菌屬細(xì)菌則耐藥。

(2)方法：用棉拭子將待檢菌菌懸液均勻涂布于堿性瓊脂平板上，將10ug/片及

150Hg/片的0/129診斷紙片貼于平板上，置35℃孵育18-24h,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：出現(xiàn)抑菌圈者表示敏感，無抑菌圈者為耐藥。

(4)應(yīng)用：主要用于弧菌屬、鄰單胞菌屬與氣單胞菌屬的鑒別，弧菌屬和鄰單胞菌屬菌

為敏感，氣單胞菌屬菌為耐藥。其它菌屬有發(fā)光桿菌屬為敏感，假單胞菌屬為耐藥。

5.觸酶試驗(H202)

(1)原理：觸酶又稱過氧化氫酶，具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫成為水和原

子態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。

(2)方法：取潔凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細(xì)菌，加3%H2021滴，立即觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：若立即出現(xiàn)大量氣泡為陽性。無氣泡為陰性。

(4)應(yīng)用：大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故常用此試驗

來鑒定。止匕外，金氏桿菌屬的細(xì)菌也為陰性。分枝桿菌的鑒別則用耐熱觸酶試驗，結(jié)核分

枝桿菌為陰性，戈氏分枝桿菌和地分枝桿菌為陽性。

注意事項：①3%11202溶液要新鮮配制。②不宜用血瓊脂平板上生長的菌落，因紅細(xì)胞

含有觸酶，可致假陽性反應(yīng)，③取對數(shù)生長期的細(xì)菌。

4.苯丙氨酸脫氨酶試驗(phenylalanine)

(1)原理：測定細(xì)菌是否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨前。細(xì)菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸

脫氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。若延長時間，會引起退色。

(2)方法：將待檢菌大量接種入苯丙氨酸培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h,滴加100g/L三氯

化鐵試劑4~5滴，立即觀察菌落生長處有無綠色出現(xiàn)。

(3)結(jié)果：有綠色出現(xiàn)為陽性。

(4)應(yīng)用：變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽性，腸桿菌科其它細(xì)菌均為陰

性。

4.B—半乳糖甘酶試驗(ONPG試驗)

(1)原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和B一半乳糖昔酶才能快速分解。有些細(xì)菌

只有半乳糖甘酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細(xì)菌均可快速

水解鄰硝基酚-P-【)-半乳糖甘(O-nitrophenyl-B-D-galactopyranoside,ONPG)而生成

黃色的鄰硝基酚。用于枸椽酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。

(2)方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35C水浴或孵箱孵育18~24h,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。

(4)應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細(xì)菌的快速鑒定，本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌

均可短時間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸椽酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌

屬和腸桿菌屬等均為試驗陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。

檸檬酸鹽

1.枸椽酸鹽利用試驗

(1)原理：某些細(xì)菌能利用枸椽酸鹽作為唯一碳源，而在此培養(yǎng)基上生長，并分解枸椽

酸鹽生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。

(2)方法：將待檢菌接種于枸檬酸鹽培養(yǎng)基上，置35℃孵育廣4d,逐日觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：若用澳麝香草酚蘭指示劑，斜面出現(xiàn)菌落或菌苔，培養(yǎng)基變藍(lán)色為陽性；無

菌落生長，培養(yǎng)基綠色為陰性。

(4)應(yīng)用：可用此試驗作細(xì)菌種屬間鑒定。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森

菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常陽性，粘質(zhì)和液化沙雷菌和某些變形桿菌及枸

椽酸桿菌陽性。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌和嗜水氣單胞菌也能利用枸椽酸

鹽。

微生物學(xué)檢驗基木技術(shù)

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及相關(guān)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各學(xué)科相互交叉和滲透，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)檢驗技術(shù)

已深入到細(xì)胞、分子和基因水平，許多新技術(shù)、新方法已在臨床微生物實驗室得到廣泛應(yīng)

用。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗室的基本任務(wù)之一是利用微生物學(xué)檢驗技術(shù)，準(zhǔn)確、快速檢驗和鑒

定臨床標(biāo)本中的微生物，并對引起感染的微生物進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，為臨床對感染性疾病診

斷、治療、流行病學(xué)調(diào)查及研究等提供科學(xué)依據(jù)。

第一節(jié)微生物形態(tài)學(xué)檢查

細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查是細(xì)菌檢驗的重要方法之一，它是細(xì)菌分類和鑒定的基礎(chǔ)，可根據(jù)其形

態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色反應(yīng)性等，為進(jìn)一步鑒定提供參考依據(jù)。

一、顯微鏡檢查

由于細(xì)菌個體微小，肉眼不能看到，必須借助顯微鏡的放大才能看到。一般形態(tài)和結(jié)構(gòu)

可用光學(xué)顯微鏡觀察，其內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)則需用電子顯微鏡才能看清楚。常用顯微鏡有如

下幾種。

1.普通光學(xué)顯微鏡

采用自然光或燈光為光源，其波長約為0.4um。顯微鏡的分辨率為波長的二分之一，即

0.2um,而肉眼可見的最小形象為0.2mm。故用油（浸）鏡放大1000倍，能招0.2um的

微粒放大成肉眼可見的0.2mm。普通光學(xué)顯微鏡可用于細(xì)菌、放線菌和真菌等的觀察。

2.暗視野顯微鏡

常用于觀察不染色微生物形態(tài)和運動。在普通顯微鏡安裝暗視野聚光器后，光線不能從

中間直接透入，視野呈暗色，當(dāng)標(biāo)本接受從聚光器邊緣斜射光后可發(fā)生散射，因此可在暗

視野背景下觀察到光亮的微生物如細(xì)菌或螺旋體等。

3.相差顯微鏡

相差顯微鏡利用相差板的光珊作用，改變直射光的光位相和振幅，將光相的差異轉(zhuǎn)換為

光強(qiáng)度差。在相差顯微鏡下，當(dāng)光線透過不染色標(biāo)本時，由于標(biāo)本不同部位的密度不一致

而引起光相的差異，可觀察到微生物形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和運動方式等。

4.熒光顯微鏡

熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡基本相同，主要區(qū)別在于光源、濾光片和聚光器。目前大

多數(shù)使用的是落射光裝置，常用高壓汞燈作為光源，可發(fā)出紫外光或藍(lán)紫光。濾光片有激

發(fā)濾光片和吸收濾光片二種。用藍(lán)光的熒光顯微鏡除可用一般明視野聚光器外，也可用暗

視野聚光器，以加強(qiáng)熒光與背景的對比。本法適用于對熒光色素染色或與熒光抗體結(jié)合的

細(xì)菌的檢測或鑒定。

5.電子顯微鏡

用電子流作為光源，波長與可見光相比差幾萬倍，大大提高了分辨力，并用磁性電圈作

為光學(xué)放大系統(tǒng)，放大倍數(shù)可達(dá)數(shù)萬倍或幾十萬倍，常用于病毒顆粒和細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的觀

察。

二、不染色標(biāo)本檢查

不染色標(biāo)本一般可用于觀察細(xì)菌形態(tài)、動力及運動情況。細(xì)菌未染色時無色透明，在顯

微鏡下主要靠細(xì)菌的折光率與周圍環(huán)境的不同來進(jìn)行觀察。有鞭毛的細(xì)菌運動活潑，無鞭

毛的細(xì)菌則呈不規(guī)則布朗運動。梅毒蒼白密螺旋體、鉤端螺旋體、彎曲桿菌等的活菌各有

特征鮮明的形態(tài)和運動方式，具有診斷意義。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細(xì)管法

等。

1.懸滴法

在潔凈凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液放在蓋玻片中央，再將凹

玻片的凹孔對準(zhǔn)蓋玻片中央的液滴并蓋上，然后迅速翻轉(zhuǎn)，輕壓蓋玻片，使其與凹孔邊緣

的凡士林粘緊封閉后置高倍鏡下（或暗視野）觀察。

2.壓滴法

用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液置于潔凈玻片的中央，在菌懸液上輕輕蓋上一蓋玻片，注意避免

產(chǎn)生氣泡并防止菌懸液外溢，靜止數(shù)秒鐘后置高倍鏡下明視野（或暗視野）觀察。

3.毛細(xì)管法

主要用于厭養(yǎng)菌動力的檢查。通常選用60~70mm長。0.51.0mm孔徑的毛細(xì)管虹吸厭養(yǎng)

菌懸液后，用火焰將毛細(xì)管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細(xì)管固定在載玻片上，置高倍鏡下

暗視野觀察。

三、染色標(biāo)本檢查

細(xì)菌標(biāo)本經(jīng)染色后，由于細(xì)菌與周圍環(huán)境間在顏色上形成鮮明對比，故在普通光學(xué)顯微

鏡下可清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)特征（如細(xì)菌的大小、形狀、排列等）和某些特殊結(jié)構(gòu)

（如莢膜、鞭毛、芽泡等），并可根據(jù)染色反應(yīng)性對細(xì)菌加以分類鑒定。

（-）細(xì)菌染色的一般程序

細(xì)菌染色的一般程序是：涂片（干燥）一固定一染色（媒染）一（脫色）一（復(fù)染）。

1.涂片制備

血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養(yǎng)物，直接在載玻片上作薄膜涂片；尸檢或感

染動物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養(yǎng)基上的菌落或菌苔的制片，

先用接種環(huán)取一環(huán)生理鹽水置載玻片中央，再用無菌接種環(huán)取少量的培養(yǎng)物在生理鹽水中

磨勻，涂布成lcm2大小的涂面，置室溫下自然干燥或遠(yuǎn)火慢慢烘干。

2.固定

目的是殺死細(xì)菌，凝固細(xì)菌蛋白及結(jié)構(gòu)，便于染色；促使細(xì)菌粘附在載玻片上，避免在

水洗過程中被水沖掉；改變細(xì)菌對染料的通透性，有利于菌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的染色。通常用火

焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。

3.染色

根據(jù)檢驗?zāi)康牟煌x擇不同的染色方法進(jìn)行染色。染色時滴加染液，以復(fù)蓋標(biāo)本為

度。

4.媒染

凡能增強(qiáng)染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能弓I起細(xì)胞膜通透性改變的物

質(zhì)，稱媒染劑。常用的有明磯、糅酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進(jìn)著色。媒染劑可

用于初染與復(fù)染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5.脫色

凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學(xué)試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色

劑。脫色劑可以查出細(xì)菌與染料結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。

6.復(fù)染

已脫色處理的細(xì)菌或其結(jié)構(gòu)常以復(fù)染液作復(fù)染以便于觀察。復(fù)染液與初染液的顏色不同

而成一鮮明對比。復(fù)染不宜太強(qiáng)，以免掩蓋初染的顏色。

（二）常用染色法（染液配方見第8章）

單染色法

只用-一種染料染色。由于大多數(shù)細(xì)菌胞漿內(nèi)含有酸性物質(zhì)，可與堿性染料結(jié)合，故常用

呂氏美藍(lán)、結(jié)晶紫和稀釋石碳酸復(fù)紅等染液。此法可觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)與排列，不能

顯示細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與染色特性。

2.復(fù)染色法

用兩種或兩種以上不同染料可將細(xì)菌染成不同的顏色，除可觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)與排

列外，還反應(yīng)出細(xì)菌染色特性，具有鑒別細(xì)菌種類的價值。常用的有革蘭染色法和抗酸染

色法。

（1）革蘭染色：①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加結(jié)晶紫染液染Imin,清水沖去染液。②加

碘液媒染Imin,水洗，甩干。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動約30s,至無紫色洗落為止，

水洗，甩干。④加稀釋石碳酸復(fù)紅或沙黃染液數(shù)滴進(jìn)行復(fù)染，約30s,水洗。⑤干后顯微

鏡下鏡檢觀察結(jié)果，革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。

（2）抗酸染色：萋-尼（Ziehl-Neelse）抗酸染色法：①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加石炭

酸復(fù)紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現(xiàn)，切不可沸騰。染液因蒸發(fā)減少時，應(yīng)隨時補(bǔ)充，防

止染液蒸干。持續(xù)染5min（奴卡菌需要加長時間），水洗，甩干。②滴加3%鹽酸乙醇脫

色，不時搖動玻片至無紅色脫落為止，水洗，甩干。③加呂氏美藍(lán)復(fù)染液數(shù)滴復(fù)染Imin,

水洗。④干后顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍(lán)色。

金胺0-羅丹明B染色法：①細(xì)菌涂片固定后加第1液30~90s。②棄去第1液后加第2

液染15min。③用第3液脫色廣2min,水洗。④滴加第4液染30s,水洗，⑤干后置熒光

顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果在淡藍(lán)色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。

3.特殊染色法

（1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的處理將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時

取出，以干凈紗布擦干。②在玻片上滴蒸儲水1滴。③挑取培養(yǎng)物少許，輕觸蒸儲水滴頂

部，僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴，不可攪動，以免鞭毛脫落。④置35℃孵箱自然干燥，不

能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1-2min輕輕水洗。⑤干后顯微鏡鏡檢觀察結(jié)果鞭毛和

菌體呈紫色。

（2）異染顆粒染色（阿爾培托法）：①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加甲液染色3~5min。水

洗。②滴加乙液，染Imino水洗。③干后顯微鏡鏡檢觀察結(jié)果菌體呈綠色，異染顆粒呈

藍(lán)黑色，用于白喉棒狀桿菌染色。

（3）莢膜染色：①奧爾特莢膜染色法：將已固定的細(xì)菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰

加溫染色，持續(xù)3min,冷卻后水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主

要用于碳疽芽胞桿菌。②Hiss氏硫酸銅法：染液：第?液為結(jié)晶紫乙醇飽和液5ml加蒸鐳

水95ml的混合液；第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細(xì)菌涂片自然干燥，乙醇固定。

滴加第一液，微加熱染Imin。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅

液，以吸水紙吸干鏡檢。結(jié)果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍(lán)色或不著色。

（4）芽胞染色：染液：第一液為萋一納氏石炭酸復(fù)紅液，第二液為95%乙醇，第三液為

堿性美藍(lán)液。方法：將已固定的細(xì)菌涂片滴加第一液，微加熱染5min,冷卻后水洗。用第

二液脫色2min,水洗。加第三液復(fù)染Imin,水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈藍(lán)色，芽胞

呈紅色。

4.負(fù)染色法

背景著色而菌體本身不著色的染色為負(fù)染色法。最常見的是墨汁負(fù)染色法，用來觀察真

菌及細(xì)菌莢膜等。在標(biāo)本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片（勿產(chǎn)生氣泡），輕壓。在低

倍鏡下尋找有莢膜的菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)高倍鏡或油鏡確認(rèn)，如新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，

背景為黑色。

5.熒光染色法

經(jīng)熒光素染色的細(xì)菌，或熒光素標(biāo)記的熒光抗體與相應(yīng)抗原的細(xì)菌、病毒結(jié)合形成的復(fù)

合物，在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。

微生物培養(yǎng)與分離方法

大多數(shù)細(xì)菌均可以通過人工方法培養(yǎng)，而衣原體和病毒的分離培養(yǎng)往往需要活組織、雞

胚、特殊細(xì)胞株及動物接種。只有將微生物培養(yǎng)出來才能對它進(jìn)行研究、鑒定和應(yīng)用。

一、接種與分離方法

根據(jù)待檢標(biāo)本的性質(zhì)、培養(yǎng)目的和所用培養(yǎng)基的種類，采用不同的接種方法。

1.平板劃線分離培養(yǎng)法

對混有多種細(xì)菌的臨床標(biāo)本，采用劃線分離和培養(yǎng)，使原來混雜在一起的細(xì)菌沿劃線在

瓊脂平板表面分離，得到分散的單個菌落，以獲得純種。臨床送檢的標(biāo)本如痰、咽試子、

泌尿生殖道的分泌物和糞便等細(xì)菌檢驗均需要借助瓊脂平板劃線分離u的菌。平板劃線分

離法通常有兩種方法：

（1）分區(qū)劃線分離法：此法常用于含菌量較多的標(biāo)本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞

便或混合細(xì)菌的分離。先用接種環(huán)挑取標(biāo)本涂布于瓊脂平板1區(qū)（占培養(yǎng)基總面積的％）

并作數(shù)條劃線，再于2、3、4區(qū)依次劃線。每劃完一個區(qū)域，均將接種環(huán)燒灼滅菌1次，

冷后再劃下-區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均與上一區(qū)域的劃線交接1~3次。-個成功分區(qū)劃線

的平板，培養(yǎng)后分別觀察1區(qū)形成菌苔，2區(qū)菌落連成線，3區(qū)和4區(qū)可分離到單個菌

落。

（2）連續(xù)劃線分離法：此法常用于含菌量不多的標(biāo)本或培養(yǎng)物中的細(xì)菌分離培養(yǎng)。方

法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹，然后再用接種環(huán)或拭子在平板表面曲線連

續(xù)劃線接種，直至劃滿瓊脂平板表面。

瓊脂斜面接種法

主要用于菌落的移種，以獲得純種進(jìn)行鑒定和保存菌種等。用接種環(huán)（針）挑取單個菌

落或培養(yǎng)物，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃-條直線，然后再從底部沿直線向上曲折連續(xù)劃

線，直至斜面近頂端處止。生化鑒定培養(yǎng)基斜面接種，用接種針挑取待鑒定細(xì)菌的菌落，

從斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種。

3.穿刺接種法

此法多用于半固體培養(yǎng)基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養(yǎng)基接種，半固體培養(yǎng)基的穿

刺接種可用于觀察細(xì)菌的動力。接種時用接種針挑取菌落，由培養(yǎng)基中央垂直刺入至距管

底0.4cm處，再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養(yǎng)基，穿刺高層部

分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。

4.液體培養(yǎng)基接種法

用于各種液體培養(yǎng)基如肉湯、蛋白陳水、糖發(fā)酵管等的接種。用接種環(huán)挑取單個菌落，

傾斜液體培養(yǎng)管，在液面與管壁交界處研磨接種物（以試管直立后液體淹沒接種物為

準(zhǔn))。此接種法應(yīng)避免接種環(huán)與液體過多接觸，更不應(yīng)在液體中混勻、攪拌，以免形成氣

溶膠，造成實驗室污染。

5.傾注平板法

本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標(biāo)本中的細(xì)菌計數(shù)。取純培養(yǎng)物的稀釋或原標(biāo)

本1血至無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再將已融化并冷卻至45、50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15~20ml傾注入

該無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，混勻，待凝固后置37℃培養(yǎng)，長出菌落后進(jìn)行菌落計數(shù)，以求出每毫升

標(biāo)本中所含菌數(shù)。先數(shù)6個方格(每格為lcm2)中菌落數(shù)，求出每格的平均菌落數(shù)，并算

出平皿直徑，然后按下列公式計數(shù)，求出每毫升標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)。

全平板菌落數(shù)=每方格的平均菌落數(shù)Xnr2

每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)=全平板菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)

6.涂布接種法

本法多用于紙片擴(kuò)散法藥敏試驗的細(xì)菌接種。將定量或適量的菌液加到瓊脂培養(yǎng)基表

面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復(fù)涂布，使被接種液均勻分布于瓊

脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養(yǎng)，本法經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)菌形成菌苔。

二、細(xì)菌的培養(yǎng)方法

根據(jù)不同的標(biāo)本及不同的培養(yǎng)目的，可選用不同的培養(yǎng)方法。通常把細(xì)菌的培養(yǎng)方法分

為需氧培養(yǎng)、二氧化碳培養(yǎng)、微需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)四種。

1.需氧培養(yǎng)

是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養(yǎng)，將已接種好的平板、斜面、液體培養(yǎng)基

等在空氣中置35℃孵育箱內(nèi)孵育18~24h,無特殊要求的細(xì)菌均可生長。少數(shù)生長緩慢的

細(xì)菌需要培養(yǎng)3-7d甚至1個月才能生長。為使孵育箱內(nèi)保持一定的濕度，可在其內(nèi)放置

一杯水。對培養(yǎng)時間較長的培養(yǎng)基，接種后應(yīng)將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士

林封固，以防培養(yǎng)基干裂。

2.二氧化碳培養(yǎng)

某些細(xì)菌，如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的

培養(yǎng)，特別是在初次分離時.，須在5%~10%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)才能生長。常用的培養(yǎng)法

如下。

(1)二氧化碳培養(yǎng)箱法：二氧化碳孵箱能自動調(diào)節(jié)二氧化碳的含量、溫度和濕度，培

養(yǎng)物置于孵育箱內(nèi)閣，孵育一定時間后可直接觀察生長結(jié)果。

(2)燭缸培養(yǎng)法：取有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃干燥器，符接種好的培養(yǎng)基放入缸內(nèi)，點

燃蠟燭后放在缸內(nèi)稍高于培養(yǎng)物的位置上，缸蓋或缸口均涂以凡士林，加蓋密閉。因缸內(nèi)

蠟燭燃燒氧逐漸減少，數(shù)分鐘后蠟燭自行熄滅，此時容器內(nèi)二氧化碳含量約占5%~10虬將

缸置于35C普通孵育箱內(nèi)孵育。

（3）氣袋法：選用無毒透明的塑料袋，招已接種標(biāo)本的培養(yǎng)皿放入袋內(nèi)，盡量祛除袋

內(nèi)空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉狀態(tài)，執(zhí)斷袋內(nèi)已置的二氧化碳

產(chǎn)氣管（安甑）產(chǎn)生二氧化碳，數(shù)分鐘內(nèi)就可達(dá)到需要的二氧化碳培養(yǎng)環(huán)境，置于35℃孵

育箱內(nèi)孵育。

（4）化學(xué)法：常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml

比例，分別置容器內(nèi)，連同容器置于玻璃缸內(nèi)，蓋緊密封，傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接

觸而生成二氧化碳。于35c孵育箱內(nèi)孵育。

3.微需氧培養(yǎng)

微需氧菌培養(yǎng)在大氣中及絕對無氧環(huán)境中均不能生長，在含有5%-6%氧氣，5%-10%二氧

化碳和85%氮氣的氣體環(huán)境中才可生長，將標(biāo)本接種到培養(yǎng)基上，置于上述氣體環(huán)境中，

35c進(jìn)行培養(yǎng)即微需氧培養(yǎng)法。

4.厭氧培養(yǎng)

厭氧菌對氧敏感，培養(yǎng)過程中需造成低氧化還原電勢的厭氧環(huán)境。厭氧培養(yǎng)常用的方法

有：物理法、化學(xué)法、生物法。如厭氧罐培養(yǎng)法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭

氧法等。

三、細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長特性

1.固體培養(yǎng)基

標(biāo)本或液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基表面后，單個細(xì)菌經(jīng)分裂繁殖可形成?個肉眼

可見的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落（colony）o

（1）菌落的形態(tài)特征：大小、形狀（露滴狀、圓形、菜花樣、不規(guī)則等）、突起或扁

平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）、顏色（紅色、灰白色、黑色、綠

色、無色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘

度等。據(jù)細(xì)菌菌落表面特征不同，可將菌落分為3型：①光滑型菌落（S型菌落）：

菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊，新分離的細(xì)菌大多呈光滑型菌落。②粗糙型菌落（R

型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型

細(xì)菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質(zhì)形成。R型細(xì)菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比

S型細(xì)菌弱。但也有少數(shù)細(xì)菌新分離的毒力株就是R型，如炭疽泡桿菌、結(jié)核分枝菌等。

③粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層

的細(xì)菌、結(jié)核桿菌等。

（2）菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。①a溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍

培養(yǎng)基出現(xiàn)廣2mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；②B溶血：又稱完全溶血，菌落周

圍形成一個完全清晰透明的溶血環(huán)，是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞完全溶解所致；③Y溶

血：即不溶血，菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，紅細(xì)胞沒有溶解或缺損。（3）色素：有些細(xì)

菌產(chǎn)生水溶性色素，使菌落和周圍的培養(yǎng)基出現(xiàn)綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏

色，產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性。

（4）氣味：某些細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長繁殖后可產(chǎn)生特殊氣味，如銅綠假單胞菌（生姜氣

味）、變形桿菌（巧克力燒焦的臭味）、厭氧梭菌（腐敗的惡臭味）、白色假絲酵母菌

（酵母味）和放線菌（泥土味）等。

2.液體培養(yǎng)基

細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中有3種生長現(xiàn)象：大多數(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基生長繁殖后呈均勻混

濁；少數(shù)鏈狀排列的細(xì)菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長；枯草芽胞桿菌、結(jié)核

分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長，常形成菌膜。

3.半固體培養(yǎng)基

半固體培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌動力試驗，有鞭毛的細(xì)菌除了沿穿刺線生長外，在穿刺線兩

側(cè)也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。無鞭毛的細(xì)菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長，穿刺

線兩邊的培養(yǎng)基仍然澄清透明，為動力試驗陰性。

細(xì)菌的生物化學(xué)試驗

各種細(xì)菌具有各自獨特的酶系統(tǒng)，因而對底物的分解能力不同，其代謝產(chǎn)物也不同。用

生物化學(xué)方法測定這些代謝產(chǎn)物，可用來區(qū)別和鑒定細(xì)菌的種類。利用生物化學(xué)方法來鑒

別不同細(xì)菌，稱為細(xì)菌的生物化學(xué)試驗或稱生化反應(yīng)。生物化學(xué)試驗的方法很多，主要有

以下幾類。

一、碳水化合物的代謝試驗

1.糖（醇、甘）類發(fā)酵試驗

（1）原理：不同種類細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖（醇、甘）類的隘，因而對各種糖（醇、

昔）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某種糖（醇、甘）類，其代謝產(chǎn)物可因菌種而

異。檢查細(xì)菌對培養(yǎng)基中所含糖（醇、甘）降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，可用以鑒定細(xì)

菌種類。

（2）方法：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（如酚紅肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH7.4）加入0.5~1.0%（w/v）的

特定糖（醇、昔）類。所使用的糖（醇、甘）類有很多種，根據(jù)不同需要可選擇單糖、多

糖或低聚糖、多元醇和環(huán)醇等，見表6-4-1。將待鑒定的純培養(yǎng)細(xì)菌接種入試驗培養(yǎng)基

中，置35c孵育箱內(nèi)孵育數(shù)小時到兩周（視方法及菌種而定）后，觀察結(jié)果。若用微量發(fā)

酵管，或要求培養(yǎng)時間較長時，應(yīng)注意保持其周圍的濕度，以免培養(yǎng)基干燥。

（3）結(jié)果：能分解糖（醇、甘）產(chǎn)酸的細(xì)菌，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)（如酚紅變

為黃色），產(chǎn)氣的細(xì)菌可在小倒管（Durham小管）中產(chǎn)生氣泡，固體培養(yǎng)基則產(chǎn)生裂隙。

不分解糖則無變化。

（4）應(yīng)用：糖（醇、甘）類發(fā)酵試驗，是鑒定細(xì)菌的生化反應(yīng)試驗中最主要的試驗，不

同細(xì)菌可發(fā)酵不同的糖（醇、昔）類，如沙門菌可發(fā)酵葡萄糖，但不能發(fā)酵乳糖，大腸

埃希菌則可發(fā)酵葡萄糖和乳糖。即便是兩種細(xì)菌均可發(fā)酵同一種糖類，其發(fā)酵結(jié)果也不盡

相同，如志賀菌和大腸埃希菌均可發(fā)酵葡萄糖，但前者僅產(chǎn)酸，而后者則產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，故

可利用此試驗鑒別細(xì)菌。

表6-4T常用于細(xì)菌糖發(fā)酵試驗的糖、醇類

單糖四碳糖：赤薛糖，五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖，六碳糖：葡萄糖果糖

半乳糖甘露糖

雙糖蔗糖（葡萄糖+果糖）乳糖（葡葡糖+半乳糖）麥芽糖（兩分子葡萄糖）三糖

棉子糖（葡萄糖+果糖+半乳糖）

多糖菊糖（多分子果糖）淀粉

醇類側(cè)金盞花醇衛(wèi)茅醇甘露醇山梨醇

非糖類肌醇

2.葡萄糖代謝類型鑒別試驗（0/F或Hugh-Leifson,HL）

（1）原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；能進(jìn)行無

氧降解的為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細(xì)菌為產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細(xì)菌無論在有氧或無氧環(huán)境中

都能分解葡萄糖，而氧化型細(xì)菌在無氧環(huán)境中則不能分解葡萄糖。本試驗又稱氧化發(fā)酵

（0/F或Hugh-Leifson,HL）試驗，可用于區(qū)別細(xì)菌的代謝類型。

（2）方法：挑取少許純培養(yǎng)物（不要從選擇性平板中挑?。┙臃N2支HL培養(yǎng)管中，在其

中一管加入高度至少為0.5cm的無菌液體石蠟以隔絕空氣（作為密封管），另一管不加

（作為開放管）。置35℃孵箱孵育48h以匕

（3）結(jié)果：兩管培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸（顏色不變）為產(chǎn)堿型；兩管都產(chǎn)酸（變黃）為發(fā)酵

型；加液體石蠟管不產(chǎn)酸，不加液體石蠟管產(chǎn)酸為氧化型。

（4）應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與其它非發(fā)酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細(xì)菌為發(fā)酵

型，非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌（發(fā)酵型）與微球菌（氧化

型）。

3.甲基紅（MR）試驗

(1)原理：某些細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步被分解為

甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培養(yǎng)基pH下降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑呈紅色。如

細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)(如醇、醛、酮、氣體和

水)，培養(yǎng)基pH在5.4以上，加入甲基紅指示劑呈桔黃色。

(2)方法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白陳水中，35℃孵育48h~96h后，于5ml培

養(yǎng)基中滴加5~6滴甲基紅指示劑，立即觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果判定：呈現(xiàn)紅色者為陽性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱陽性。

(4)應(yīng)用：常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別，如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽

性，后者為陰性。腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門菌屬、志賀菌屬、枸椽酸桿菌

屬和變形桿菌屬等為陽性。

4.8一半乳糖甘酶試驗(ONPG試驗)

(1)原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透醐和B—半乳糖甘酶才能快速分解。有些細(xì)菌

只有半乳糖甘酷，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細(xì)菌均可快速

水解鄰硝基酚-B-D-半乳糖昔(O-nitrophenyl-6-D-galactopyranoside,ONPG)而生成

黃色的鄰硝基酚。用于枸椽酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。

(2)方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35c水浴或孵箱孵育18~24h,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。

(4)應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細(xì)菌的快速鑒定，本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌

均可短時間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸椽酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌

屬和腸桿菌屬等均為試驗陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。

5.VP試驗

(1)原理：測定細(xì)菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力。某些細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)

生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步脫峻形成乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成

二乙酰，進(jìn)而與培養(yǎng)基中的精氨酸等含服基的物質(zhì)結(jié)合形成紅色化合物。即V-P試驗陽

性。(2)方法：將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白陳水中，35℃孵育24~48h,加入

50g/La-蔡酚(95%乙醇溶液)0.6ml,輕輕振搖試管，然后加0.2ml400g/LKOH,輕輕

振搖試管30s至Imin,然后靜置觀察結(jié)果。(3)結(jié)果：紅色者為陽性，黃色或類似銅色為

陰性。

(4)應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本試驗常與MR試驗一起使用，一

般情況下，前者為陽性的細(xì)菌，后者常為陰性，反之亦然。但腸桿菌科細(xì)菌不一定都這樣

規(guī)律，如蜂房哈夫尼亞菌和奇異變形桿菌的VP試驗和MR試驗常同為陽性。

6.膽汁七葉背水解試驗

(1)原理：在10%~40%膽汁存在下，測定細(xì)菌水解七葉甘的能力。七葉甘被細(xì)菌分解

生成的七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸椽酸鐵的二價鐵離子發(fā)生反應(yīng)形成黑色化合物。

(2)方法：將被檢菌接種于膽汁七葉甘培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h后，觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：培養(yǎng)基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。

(4)應(yīng)用：主要用于鑒別D群鏈球菌與其它鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某

些厭氧菌(如脆弱擬桿菌等)的初步鑒別。D群鏈球菌本試驗為陽性。

7.淀粉水解試驗

(1)原理：產(chǎn)生淀粉前的細(xì)菌能將淀粉水解為糖類，在培養(yǎng)基上滴加碘液時，可在菌落

周圍出現(xiàn)透明區(qū)。

(2)方法：將被檢菌劃線接種于淀粉瓊脂平板或試管中，35℃孵育18、24h,加入革蘭碘

液數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：陽性反應(yīng)，菌落周圍有無色透明區(qū)，其它地方藍(lán)色；陰性反應(yīng)，培養(yǎng)基全部

為藍(lán)色。

(4)應(yīng)用：用于白喉棒狀桿菌生物型的分型，重型淀粉水解試驗陽性，輕、中型陰性；

芽胞桿菌屬菌種和厭氧菌某些種的鑒定。

8.甘油復(fù)紅試驗

(1)原理：甘油可被細(xì)菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脫去段基為乙醛，乙醛與無色的復(fù)紅

生成釀式化合物，呈深紫紅色。

(2)方法：取被檢菌接種于甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基中，于35c孵育，觀察2~8d。應(yīng)同時做

陰性對照。

(3)結(jié)果：紫紅色為陽性，與對照管顏色相同為陰性。

(4)應(yīng)用：主要用于沙門菌屬內(nèi)各菌種間的鑒別。傷寒沙門菌、甲(丙)型副傷寒沙門

菌、豬霍亂沙門菌、孔道夫沙門菌和仙臺沙門菌本試驗為陰性，乙型副傷寒沙門菌結(jié)果不

定，其它不常見沙門菌多數(shù)為陽性。

9.葡萄糖酸氧化試驗

(1)原理：某些細(xì)菌可氧化葡萄糖酸鉀，生成酮基葡萄糖酸。a-酮基葡萄糖酸是一

種還原性物質(zhì)，可與班氏試劑起反應(yīng)，出現(xiàn)棕色或磚紅色的氧化亞銅沉淀。

(2)方法：將待檢菌接種于葡萄糖酸鹽培養(yǎng)基中(1ml),置350c孵育48h,加入班氏試劑

1ml,于水浴中煮沸l(wèi)Omin并迅速冷卻，觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：出現(xiàn)黃到磚紅色沉淀為陽性。不變或仍為藍(lán)色為陰性。

(4)應(yīng)用：主要用于假單胞菌的鑒定和腸桿菌科菌分群。

二、氨基酸和蛋白質(zhì)的代謝試驗

1.硫化氫試驗

(1)原理：某些細(xì)菌能分解含硫氨基酸生成硫化氫，與亞鐵離子或鉛離子結(jié)合形成黑色

沉淀物。

(2)方法：將待檢菌接種于含硫化物及亞鐵離子的培養(yǎng)基或克氏雙糖鐵瓊脂(KIA)中，

35c孵育18~24h,觀察有無黑色沉淀出現(xiàn)?；蛴么姿徙U紙條，懸掛于K1A管中(白色濾

紙，根據(jù)試管大小裁剪適當(dāng)，在熱的50g/L醋酸鉛飽和水溶液中浸泡，然后于50~60℃烘

干，121C15min高壓滅菌備用)。醋酸鉛是最敏感的方法。

(3)結(jié)果：有黑色沉淀物為陽性。

(4)應(yīng)用：主要用于鑒別腸桿菌科細(xì)菌，如沙門菌屬、枸椽酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛

德華菌屬等為陽性，其它菌屬大多為陰性。但沙門菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲

型副傷寒、仙臺、豬霍亂沙門菌等。

2.明膠液化試驗

(1)原理：細(xì)菌分泌的胞外蛋白水解醐(明膠醒)能分解明膠，使明膠失去凝固能力而

液化。

(2)方法：將待檢菌接種于明膠培養(yǎng)基中，35℃孵育24h到7d或更長時間，每24h取出

放入4℃冰箱約2h后，觀察有無凝固。

(3)結(jié)果：如無凝固，則表示明膠已被水解，液化試驗陽性。如凝固，則繼續(xù)培養(yǎng)。

(3)應(yīng)用：奇異變形桿菌、普通變形桿菌、沙雷菌屬和陰溝腸桿菌等到能液化明膠，腸

桿菌科中的其它細(xì)菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化

明膠。另外，許多假單胞菌也能產(chǎn)生明膠酶而使明膠液化。

3.口引腺試驗(靛基質(zhì)試驗)

(1)原理：某些細(xì)菌有色氨酸酶，能分解色氨酸產(chǎn)生叫跺，叫噪與對二甲氨基苯甲醛形

成紅色的玫瑰口引噪。

(2)方法：將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白陳水培養(yǎng)基中，35c孵育24~48h,加入靛

基質(zhì)試劑，觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：紅色為陽性，無色為陰性。

(4)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定，如大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌

和產(chǎn)酸克雷伯菌等的鑒別。

4.苯丙氨酸脫氨酶試驗

(1)原理：測定細(xì)菌是否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶。細(xì)菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸

脫氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。若延長時間，會引起退色。

(2)方法：將待檢菌大量接種入苯丙氨酸培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h,滴加100g/L三氯

化鐵試劑4~5滴，立即觀察菌落生長處有無綠色出現(xiàn)。

(3)結(jié)果：有綠色出現(xiàn)為陽性。

(4)應(yīng)用：變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽性，腸桿菌科其它細(xì)菌均為陰

性。

5.氨基酸脫酸酶試驗

(1)原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生氨基酸脫竣酶使氨基酸脫竣生成胺和二氧化碳。由于胺的生

成使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，可用指示劑指示出來。

(2)方法：將待檢菌分別接種于1支氨基酸(賴氨酸，鳥氨酸或精氨酸)脫竣酶試驗管

和1支氨基酸脫竣酶對照管(無氨基酸)，各覆蓋至少0.5cm高度的無菌石蠟油，35℃孵

育l-4d,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：若為澳甲酚紫指示劑，則試驗管紫色為陽性，黃色為陰性，對照管應(yīng)為黃

色。

(4)應(yīng)用：主要用于某些細(xì)菌種間的鑒別，如賴氨酸用于產(chǎn)氣腸桿菌(陽性)與陰溝腸

桿菌(陰性)；鳥氨酸用于陰溝腸桿菌(陽性)和克雷伯菌(陰性)；精氨酸用于陰溝腸

桿菌(陽性)和產(chǎn)氣腸桿菌(陰性)等。

6.精氨酸雙水解酶試驗

(1)原理：精氨酸經(jīng)兩次水解后，生成鳥氨酸、氨及二氧化碳。鳥氨酸又在脫竣酶的作用

下生成腐胺。氨及腐胺均為堿性物質(zhì)，故可使培養(yǎng)基變堿，用指示劑指示出來。方法：

將待檢菌接種于試驗培養(yǎng)上，置35℃孵箱孵育;4d,觀察結(jié)果。

結(jié)果：浪甲酚紫指示劑呈紫色為陽性，酚紅指示劑呈紅色為陽性。黃色為陰性。應(yīng)

用：主要用于腸桿菌科及假單胞菌屬的鑒定。

7.尿素的試驗

(1)原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基變堿。

(2)方法：將待檢菌接種于含有尿素的培養(yǎng)基中，35C孵育18~24h,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：紅色為陽性，不變?yōu)殛幮浴?/p>

(4)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科變形桿菌屬、普羅威登菌屬、克雷伯菌屬及假單胞菌屬的

鑒定。

8.霍亂紅試驗

(1)原理：霍亂弧菌分解色氨酸生成吧腺，并能使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，當(dāng)加入硫酸

后生成亞硝酸叫I噪，呈紅色反應(yīng)。

(2)方法：將待檢菌接種于蛋白陳水中，置350c孵育24h,加入濃硫酸數(shù)滴，觀察結(jié)

果。

(3)結(jié)果：呈紅色者為陽性。

(4)應(yīng)用：霍亂弧菌呈陽性反應(yīng)，但本試驗并非霍亂弧菌所特有。凡能產(chǎn)生叫睬并還原

硝酸鹽為亞硝酸鹽的細(xì)菌，均可呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。

三、碳源和氮源利用試驗

1.枸椽酸鹽利用試驗

(1)原理：某些細(xì)菌能利用枸椽酸鹽作為唯一碳源，而在此培養(yǎng)基上生長，并分解枸椽

酸鹽生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。

(2)方法：將待檢菌接種于枸椽酸鹽培養(yǎng)基上，置35℃孵育廣4d,逐日觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：若用澳麝香草酚蘭指示劑，斜面出現(xiàn)菌落或菌苔，培養(yǎng)基變藍(lán)色為陽性；無

菌落生長，培養(yǎng)基綠色為陰性。

(4)應(yīng)用：可用此試驗作細(xì)菌種屬間鑒定。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森

菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常陽性，粘質(zhì)和液化沙雷菌和某些變形桿菌及枸

椽酸桿菌陽性。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌和嗜水氣單胞菌也能利用枸椽酸

鹽。

2.丙二酸鹽利用試驗

(1)原理：某些細(xì)菌能利用丙二酸鹽作為唯一碳源，丙二酸鹽被分解生成碳酸鈉，使培

養(yǎng)基變堿。

(2)方法：將待檢菌接種于丙二酸鹽培養(yǎng)基中，置35℃孵育24~48h,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽性。顏色無變化為陰性。

(4)應(yīng)用：腸桿菌科中亞利桑那菌和克雷伯菌屬為陽性，枸椽酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈

夫尼亞菌屬有不同生物型反應(yīng)，其它各菌屬均為陰性。

3.醋酸鈉利用試驗

(1)原理：細(xì)菌利用銹鹽作為唯一氮源，同時、利用醋酸鹽作為唯一碳源時:可在醋酸

鹽培養(yǎng)上生長，分解醋酸鹽生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。

(2)方法：將被檢菌接種于醋酸鹽培養(yǎng)基中，置35℃孵育爰7d,逐日觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：培養(yǎng)基上有細(xì)菌生長，并變?yōu)樗{(lán)色為陽性。

應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和志賀菌屬的鑒別，前者為陽性，而后者為陰性。

4.馬尿酸鈉水解試驗

(1)原理：某些細(xì)菌可具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸，茶甲酸

與三氯化鐵試劑結(jié)合，形成苯甲酸鐵沉淀。

(2)方法：將待檢菌接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基中，置35℃孵育48h,離心沉淀，取上清液

0.8ml,加入三氯化鐵試劑0.2ml,立即混勻,經(jīng)10~15min觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：出現(xiàn)恒定之沉淀物為陽性。

應(yīng)用：主要用于B群鏈球菌的鑒定。

5、乙酰胺利用試驗

(1)原理：許多非發(fā)酵菌產(chǎn)生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經(jīng)脫酰胺作用釋放氨，使培養(yǎng)

基變堿。

(2)方法：將被檢菌接種了乙酰胺培養(yǎng)基中，置35℃孵育24~48h,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽性。如不生長，或稍有生長，但培養(yǎng)基顏色不變

為陰性。

(4)應(yīng)用：主要用于非發(fā)酵菌的鑒定。銅綠假單胞菌、去硝化產(chǎn)堿桿菌、食酸假單胞菌

為陽性，其它非發(fā)酵菌大多數(shù)為陰性。

四、酶類試驗

1.氧化酶試驗

(1)原理：氧化的又稱細(xì)胞色素氧化醐，是細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)中的最終呼吸的。此前

并不直接與氧化酶試劑起反應(yīng)，而是先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使

對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。因此，本試驗結(jié)果與細(xì)胞色素C的存在有關(guān)。

(2)方法：取潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加氧化酶試劑(10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水

溶液或10g/L鹽酸二甲基對苯二胺水溶液)1滴，Imin內(nèi)觀察結(jié)果。也可將試劑滴加到菌

落上進(jìn)行試驗。

(3)結(jié)果：陽性者立即變粉紅色，510s內(nèi)呈深紫色。無色為陰性。

(4)應(yīng)用：用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細(xì)菌均陽性。此外，也用于假單胞菌屬與腸

桿菌科細(xì)菌的區(qū)別，前者陽性，而后者陰性。莫拉菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等均為陽性。注意

事項：①試驗時應(yīng)避免接觸含鐵物質(zhì)，以免出現(xiàn)假陽性。②10g/L鹽酸四甲基對苯二胺或

10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液為無色溶液，在空氣中易被氧化而失效，故應(yīng)經(jīng)常更換

新試劑，并盛于棕色瓶中，若試劑已變成深藍(lán)色，應(yīng)棄去不用。

2.觸酶試驗

(1)原理：觸能又稱過氧化氫酶，具有過氧化氫能的細(xì)菌，能催化過氧化氫成為水和原

子態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。

(2)方法：取潔凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細(xì)菌，加3%H2021滴，立即觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：若立即出現(xiàn)大量氣泡為陽性。無氣泡為陰性。

(4)應(yīng)用：大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故常用此試驗

來鑒定。此外，金氏桿菌屬的細(xì)菌也為陰性。分枝桿菌的鑒別則用耐熱觸酶試驗，結(jié)核分

枝桿菌為陰性，戈氏分枝桿菌和地分枝桿菌為陽性。

注意事項：①3%H202溶液要新鮮配制。②不宜用血瓊脂平板上生長的菌落，因紅細(xì)胞

含有觸酶，可致假陽性反應(yīng)，③取對數(shù)生長期的細(xì)菌。

3.凝固酶試驗

(1)原理：凝固酶試驗是鑒定葡萄球菌致病性的重要試驗。致病性葡萄球菌可產(chǎn)生兩種

凝固前，一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝聚因子，稱結(jié)合凝固酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白

原，使發(fā)生沉淀，包圍于細(xì)菌外面而凝聚成塊，玻片法陽性結(jié)果是由此凝聚因子所致；另

一種凝固的是分泌至菌體外，稱為游離凝固酶，它能使凝血醐原變成凝血的類產(chǎn)物，使纖

維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，從而使血漿凝固。試管法可同時測定結(jié)合型和游離型凝固能。

(2)方法：①玻片法：在一張潔凈玻片中央加1滴生理鹽水，用接種環(huán)取待檢培養(yǎng)物與

其混合(設(shè)陽性和陰性對照)制成菌懸液，若經(jīng)10~20s內(nèi)無自凝現(xiàn)象發(fā)生，則加入人或

兔新鮮血漿1環(huán)，與菌懸液混合，觀察結(jié)果。②試管法：于試管內(nèi)加1：4稀釋的兔或人

血漿0.5ml,再加廣2個待試菌菌落，置37c水浴，每30min觀察1次結(jié)果。

(3)結(jié)果：①玻片法：5'10s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性。②試管法：如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)

為陽性。2h后無上述現(xiàn)象出現(xiàn)，則放置過夜后再觀察。

(4)應(yīng)用：本試驗僅用于致病性葡萄球的鑒定。

注意事項：①玻片法為篩選試驗，陽性、陰性均需進(jìn)行試管法測定。②血漿必須新鮮。

③應(yīng)使用肝素而非枸椽酸鹽作抗凝劑抗凝的血漿。④本試驗也可用市購的膠乳凝集試驗試

劑盒測定。

4.DNA酶試驗

(1)原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生DNA酶，水解外源性DNA使之成為寡核甘酸。DNA可被酸沉

淀，而寡核甘酸則不會。故在DNA瓊脂平板上加鹽酸后，可在菌落周圍形成透明區(qū)。

(2)方法：在DNA瓊脂平板上點種待檢菌，35c孵育18、24h,用1mol/L鹽酸傾注平

板，觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：如菌落周圍有透明區(qū)者為陽性，無透明區(qū)為陰性。

(4)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科及葡萄球菌屬某些菌種的鑒定。沙雷菌、變形桿菌和金黃

色葡萄球菌DNA酶均陽性。

5.膽汁溶菌試驗

(1)原理：膽汁或去氧膽酸鈉能導(dǎo)致某些細(xì)菌溶解，一方面是由于膽汁或去氧膽酸鈉降

低了細(xì)菌細(xì)胞膜上的表面張力，使細(xì)菌的細(xì)胞膜破損或使菌體裂解。另一方面可能與激活

細(xì)菌體內(nèi)的自溶酶有關(guān)。

(2)方法：①試管法：用純培養(yǎng)物制備1ml生理鹽水濃菌懸液，pH調(diào)至7.0,分裝兩支

試管，各0.5ml。其中一管加0.5ml100g/L去氧膽酸鈉為試驗管，另一管加0.5ml生理鹽

水作對照。35c孵育每小時觀察1次結(jié)果。②平板法：在血平板上選取單個可疑菌落，作

好標(biāo)記，直接在菌落上加1接種環(huán)20g/L去氧膽酸鈉(pH7.0),置35℃孵育30min(平

板不要翻轉(zhuǎn))觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：①試管法：在3h內(nèi)液體透明為陽性。②平板法：如菌落消失，僅留下溶血區(qū)

為陽性，菌落不消失為陰性。

(4)應(yīng)用：用于肺炎鏈球菌的鑒定。

6.硝酸鹽還原試驗

(1)原理：硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個過程，其一是在合成代謝過程中，硝酸鹽還原為亞

硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其它含氮化合物；另一是在分解代謝過程中，

硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸醐系統(tǒng)中的終末受氫體。硝酸鹽還原過程可因細(xì)菌不同

而異。有的細(xì)菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌等；有的細(xì)菌可使其還原為亞

硝酸鹽和離子態(tài)的鏤；有的細(xì)菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如沙雷菌屬；有的細(xì)菌

還可以將其還原產(chǎn)物在合成性代謝中完全利用。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果還原生成氣體的終

末產(chǎn)物如氮或氧化氮，則稱為脫硝化或脫氮化作用。某些細(xì)菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，

亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺

酸，后者與a-蔡胺結(jié)合生成N-a秦胺偶苯磺酸。

(2)方法：將待檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基(內(nèi)含小倒管)中，35℃孵育廣4d。將甲、乙

等量混合液(用時混合)0.1ml加于試管內(nèi)，立即或lOmin內(nèi)觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性反應(yīng)。如欲觀察有無氮氣產(chǎn)生，可于培養(yǎng)基管內(nèi)加1只小倒

管，有氣泡產(chǎn)生，則表示有氮氣生成。如欲檢查培養(yǎng)基中硝酸鹽是否被分解，可取鋅粉少

許加入培養(yǎng)基內(nèi)，如出現(xiàn)紅色表明硝酸鹽仍存在；若不出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽已被分解。

(4)應(yīng)用：本試驗廣泛用于細(xì)菌鑒定。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；假單

胞菌屬中有的細(xì)菌能產(chǎn)生氮氣，如銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、斯氏假單胞菌，有

的則能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，如鼻疽假單胞菌等；厭氧菌如韋榮菌也能還原硝酸鹽為亞

硝酸鹽。

7.卵磷脂酶試驗

(1)原理：細(xì)菌產(chǎn)生的卵磷脂酶，經(jīng)鈣離子作用，能迅速分解卵黃或血清中的卵磷脂形

成混濁沉淀狀的甘油酯和水溶性磷酸膽堿。

(2)方法：取待檢菌劃線接種或點種在卵黃瓊脂平板上，置35℃孵育3飛h,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：3h后在菌落周圍形成乳白色混濁，即為卵磷脂酶試驗陽性，6h后該混濁圈可

擴(kuò)大到直徑5~6mm。

(4)應(yīng)用：該試驗主要用于厭氧的鑒定。產(chǎn)氣莢膜梭菌和諾維梭菌為陽性，其他梭菌為

陰性。蠟樣芽泡桿菌亦為陽性。

8.磷酸酶試驗

(1)原理：磷酸醐是磷酸脂的水解防，可使單磷脂水解，其反應(yīng)可根據(jù)反應(yīng)基質(zhì)不同而

異，如用磷酸酚戳為基質(zhì)，經(jīng)磷酸酶水解后可釋放酚幀，在堿性環(huán)境中呈紅色。