《飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩查 膠體金快速定量法》

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DB36

江西省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB36/TXXX—XXXX

飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩

查

膠體金快速定量法

Screeningofaflatoxininanimalfeedingstuffs

——RapidQuantitativeMethodofColloidalGoldTechnique

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XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

江西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

DBXX/TXXX—XXXX

目??次

前??言.............................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3原理...............................................................................1

4試劑和材料.........................................................................1

5儀器和設(shè)備.........................................................................2

6試樣制備與保存.....................................................................2

7分析步驟...........................................................................2

8結(jié)果表述...........................................................................2

9重復(fù)性.............................................................................3

附錄A（資料性附錄）膠體金快速定量檢測產(chǎn)品性能評價要求...............................4

I

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飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩查膠體金快速定量法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用膠體金免疫層析法快速篩查測定飼料及飼料原料中黃曲霉毒素，為定量篩查方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米、小麥、大米、黃豆、豆粕、花生粕、DDGS等原料及以玉米粉，小麥粉為主要基

質(zhì)的飼料成品中黃曲霉毒素的快速定量篩查。定量檢測限為4μg/kg(ppb)，檢測范圍為4μg/kg

(ppb)—100μg/kg(ppb)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T20195動物飼料試樣的制備

3原理

本方法應(yīng)用了免疫層析原理。將氯金酸用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒，標(biāo)記針對黃曲霉毒素

的單克隆抗體，用噴金法固定于硝酸纖維素（NC）膜上，同時，在硝酸纖維素（NC）膜的顯色區(qū)域有兩

個條帶：質(zhì)控帶和檢測帶，質(zhì)控條帶上包被有黃曲霉毒素抗原，檢測條帶上包被有抗黃曲霉毒素單克隆

抗體的二抗。試樣提取液中的黃曲霉毒素與檢測條中膠體金微粒上的單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，形成氯金酸

-抗體-抗原聚合物，此聚合物和剩余的氯金酸-抗體聚合物在側(cè)流作用下移動，當(dāng)?shù)竭_(dá)質(zhì)控線時，質(zhì)控

條帶上包被的抗原與剩余的氯金酸-抗體聚合物結(jié)合發(fā)生呈色反應(yīng)，顏色深淺與試樣中黃曲霉毒素毒素

含量負(fù)相關(guān)，而氯金酸-抗體-抗原聚合物繼續(xù)在側(cè)流作用下移動，到達(dá)檢測條帶后，與檢測條帶上的二

抗形成氯金酸-抗體-抗原&二抗的聚合物，此條帶的顏色同試樣中的黃曲霉毒素含量正相關(guān)。由于試樣

中的黃曲霉毒素的含量一定，質(zhì)控帶的顏色和檢測帶的顏色此消彼長，等試驗反應(yīng)平衡后，用讀數(shù)儀掃

描檢測條上顯色區(qū)域內(nèi)檢測條帶和質(zhì)控條帶顏色深淺，根據(jù)顏色深淺和讀數(shù)儀內(nèi)置曲線計算出試樣中黃

曲霉毒素含量。

4試劑和材料

除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T6682二級水的規(guī)定。

4.1膠體金免疫層析快速篩查組件（參見附錄A）。

4.1.1黃曲霉毒素殘留檢測試紙條。

4.1.2樣本稀釋液。

4.2甲醇。

4.3氫氧化鈉（NaOH1mol/L）：稱取40g氫氧化鈉，加水定容至1000ml，混勻。

4.4鹽酸溶液（HCL，1mol/L）：量取83.33mLρ=1.18g/mL的鹽酸，加水定容至1000mL，混勻。

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4.570%甲醇：量取70mL甲醇，加入30mL水，混勻。

5儀器和設(shè)備

5.1天平：感量0.01g。

5.2渦旋儀。

5.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥3000r/min。

5.4微量移液器：20μL～200μL。

5.5聚苯乙烯離心管：2mL，50mL。

5.6讀數(shù)儀：可測定并顯示膠體金定量檢測條的測定結(jié)果。

6試樣制備與保存

6.1試樣制備

按GB/T20195要求制備試樣。

6.2試樣保存

將試樣于-10℃～-20℃下避光保存。

7分析步驟

7.1試樣提取

7.1.1稱取(5.00±0.01)g谷物樣品至50mL聚苯乙烯離心管中，加入10mL70%甲醇（4.5），將

瓶塞蓋緊，渦動3min，室溫3000r/min以上離心5min，取100μL上清液加入200μL樣本稀

釋液（4.1.2），混勻，待測。

7.1.2非谷物基質(zhì)，如果上清液pH值小于6或大于8，則需要用1mol/L氫氧化鈉（4.3）溶液或1

mol/L鹽酸溶液（4.4）調(diào)節(jié)pH至7左右，然后取100μL此溶液加入200μL樣本稀釋液（4.1.2），

混勻，待測

7.1.3不同廠家的黃曲霉毒素膠體金快速定量條所用的樣品制備方法不同，如提供黃曲霉毒素膠體金

快速定量檢測條使用說明，則按照使用說明中規(guī)定的方法進(jìn)行操作。

7.2試樣篩查

7.2.1將膠體金檢測條（4.1.1）從冷藏狀態(tài)（2℃-8℃）取出放置至最適試驗溫度23℃-25℃。將讀

數(shù)儀（5.6）打開，按照提示輸入樣品，檢測人員，檢測項目，方法等相關(guān)信息。將比色卡平放于桌面，

用讀數(shù)儀掃描比色卡上的二維碼，等待檢測。

7.2.2準(zhǔn)確移取100μL待測溶液（7.1），加入檢測條加樣孔中，準(zhǔn)確計時5分鐘。

7.2.3孵育5min后，用讀數(shù)儀掃描檢測卡，按下讀取鍵，幾秒鐘讀數(shù)儀的屏幕上即可顯示測試樣中黃

曲霉毒素的含量信息。

7.2.4如結(jié)果顯示：invalid,如果檢測條上質(zhì)控線（C線）無色，測試線（T線）上顏色肉眼可見很

深，則表明試樣中黃曲霉毒素含量非常高，可將試樣提高稀釋倍數(shù)，重新進(jìn)行檢測。

8結(jié)果表述

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黃曲霉毒素含量以ppb(μg/kg微克每千克）表示，由讀數(shù)儀直接顯示和讀取。

9重復(fù)性

在同一實驗室，由同一操作者使用相同儀器，按相同的測定方法，并在短時間內(nèi)對同一被測試對象

相互獨立進(jìn)行測試獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值大于算術(shù)平均值20%的情況不超過5%。

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AA

附錄A

（資料性附錄）

膠體金快速定量檢測產(chǎn)品性能評價要求

A.1樣本稀釋液配制（能達(dá)到相當(dāng)效果者均可）

磷酸二氫鉀0.2g

十二水合磷酸氫二鈉2.9g

氯化鈉8.0g

氯化鉀0.2g

加水定容至1000mL。

A.2基本要求

A.2.1工作環(huán)境要求

氣溫：23℃～25℃。

A.2.2抗原要求

黃曲霉毒素半抗原與載體蛋白進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，能夠達(dá)到包被要求。

A.2.3抗體要求

用黃曲霉毒素抗原免疫小鼠，制備針對黃曲霉毒素的特異性單克隆抗體，能夠達(dá)到檢測要求

A.3原材料要求

A.3.1樣品墊：玻璃纖維或無紡布。

A.3.2金釋放墊：玻璃纖維片，免疫金釋放時間小于10min，釋放效率大于90%。

A.3.3反應(yīng)膜：硝酸纖維素膜，孔徑為0.45μm，4cm浸潤時間不小于140s。

A.3.4吸水紙。

A.3.5塑料卡盒：丙烯腈、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物。

A.4性能要求

A.4.1準(zhǔn)確度

采用10μg/kg（10ppb）、20μg/kg（20ppb）和50μg/kg（50ppb）三個濃度水平的陽性樣品，每個濃

度水平測定不低于6次，通過偏差來表達(dá)，3個濃度水平的6次重復(fù)的偏差均應(yīng)控制在-20%～+20%之間。