Sci Adv 浙江大學(xué)與中南大學(xué)研究團隊聯(lián)合揭示心臟搭橋術(shù)引起并發(fā)癥的關(guān)鍵機制

ScienceAdvances|浙江大學(xué)與中南大學(xué)聯(lián)合揭示心臟搭橋術(shù)引起并發(fā)癥的關(guān)鍵機制搭橋動脈粥樣硬化及再狹窄是冠狀動脈旁路移植術(shù)(CoronaryArteryBypassGrafting,CABG)后的主要并發(fā)癥，嚴重制約冠心病患者的長期生存率。因此迫切需要有效的措施改善或延緩搭橋血管狹窄的形成，進而減少缺血事件的再發(fā)生。尋找直接靶向內(nèi)皮細胞死亡和炎癥的調(diào)控因子，有望在內(nèi)皮功能損傷早期進行干預(yù)，突破當(dāng)前動脈搭橋慢性血管重構(gòu)防治的瓶頸。目前認為內(nèi)皮損傷、血栓形成、免疫激活和內(nèi)皮功能障礙是引發(fā)搭橋動脈血管重構(gòu)再狹窄的主要因素。而血管平滑肌細胞（SMCs）的增殖是血管損傷后內(nèi)膜形成的主要原因。受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）是RIP家族中第一個成員，從其被發(fā)現(xiàn)就成為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域的研究熱點，目前RIPK1已經(jīng)成為制藥界中重要的藥物靶標(biāo)。有研究報道，RIPK1的三種底物（RIPK1、DAB2IP和Drp1）分別調(diào)控著細胞死亡、炎癥和替代線粒體自噬途徑（圖1）。因此，內(nèi)皮RIPK1是否能通過特定底物調(diào)控動脈旁路移植中的內(nèi)膜形成是一個關(guān)鍵問題。圖1RIPK1在細胞炎癥和凋亡起重要作用（圖片轉(zhuǎn)自Innodrugs）浙江大學(xué)徐清波，中南大學(xué)陸瑤及翁良共同通訊在ScienceAdvances

發(fā)表題為“EndothelialRIPK1protectsarterybypassgraftagainstarteriosclerosisbyregulatingSMCgrowth”的研究論文。此研究在華盈生物的協(xié)助下進行細胞因子廣篩抗體芯片實驗，再輔以免疫共沉淀（co-IP）實驗和質(zhì)譜（LC-MS/MS）實驗，揭示了內(nèi)皮細胞RIPK1對自體動脈搭橋術(shù)后平滑肌細胞增殖和血管重構(gòu)的重要影響和作用機制。01構(gòu)建動脈旁路移植血管小鼠模型研究人員首先建立了一個小鼠動脈旁路移植模型（圖2A），該模型復(fù)制了CABG中人類血管重建病理的關(guān)鍵特征，包括管腔狹窄和內(nèi)膜增厚（圖2B）。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)增厚區(qū)域主要由SMCs組成（圖2C），對粘附因子和炎癥細胞的檢測發(fā)現(xiàn)動脈旁路移植造成一定的內(nèi)皮激活和功能障礙，引發(fā)炎癥浸潤（圖2D）。圖2動脈旁路移植血管小鼠模型及表型特征02構(gòu)建RIPK1特異性敲除小鼠動脈旁路移植血管模型為了研究ECs和SMCs之間的相互作用，研究人員首先構(gòu)建了內(nèi)皮細胞RIPK1特異性敲除（KO）小鼠的動脈搭橋模型（圖3A）。發(fā)現(xiàn)搭橋術(shù)后野生型小鼠中出現(xiàn)逐漸進展的以新生內(nèi)膜增厚和平滑肌異常增殖為特點的向心性狹窄（圖3B），并伴隨以炎癥激活狀態(tài)（圖3C-E）。圖3RIPK1特異性敲除小鼠搭橋動脈病理重構(gòu)隨后將ECs和SMCs通過直接培養(yǎng)或間接培養(yǎng)的方式（圖4A），借助流式細胞術(shù)和免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)ECs中RIPK1的缺失可以通過直接調(diào)節(jié)ECs和SMCs之間的相互作用來顯著促進SMC的增殖（圖4B,C）。圖4ECs和SMCs直接培養(yǎng)或間接培養(yǎng)實驗03細胞因子廣篩抗體芯片確定關(guān)鍵功能蛋白細胞因子廣篩抗體芯片是將高度特異的細胞因子捕獲抗體結(jié)合在經(jīng)化學(xué)修飾的玻璃片基上，再通過高親和的配對檢測抗體進行信號放大，實現(xiàn)對微量細胞因子的有效檢測。華盈生物推出的細胞因子廣篩抗體芯片技術(shù)，一次性可對上千種細胞因子進行同步篩選和檢測，特別適合大量候選細胞因子的篩選和檢測研究。為了確定ECs中RIPK1KO刺激SMC增殖的潛在機制，研究人員使用L507細胞因子廣篩抗體芯片（華盈生物提供該研究中的抗體芯片檢測服務(wù)）篩選了內(nèi)皮細胞RIPK1敲除后的相關(guān)分泌蛋白，發(fā)現(xiàn)分泌型SonicHedgehog蛋白（N-Shh）改變最為顯著（圖5A-C）。并進一步通過ELISA、qPCR、免疫熒光等方法分別在體內(nèi)和體外共同驗證了內(nèi)皮細胞特異性敲除RIPK1后N-Shh的分泌狀態(tài)和異常增殖的平滑肌細胞中下游Shh信號通路的激活狀態(tài)（圖5D,E）。之前研究報道，細胞釋放的N-shh可與膜受體PTCH1結(jié)合，并激活Hedgehog信號通路。RIPK1cKO中轉(zhuǎn)錄因子GLT1（Hedgehog信號通路的靶基因）的高表達（圖5F），表明ECs中RIPK1的敲低增加N-shh分泌，激活了SMCs中的Hedgehog通路。圖5L507細胞因子廣篩抗體芯片確定作用靶點04RIPK1通過調(diào)控N-Shh分泌調(diào)控血管重構(gòu)的機制研究為了進一步探究內(nèi)皮細胞RIPK1通過調(diào)控N-Shh分泌進而導(dǎo)致SMCs增殖和搭橋血管重構(gòu)的分子機制，研究人員首先利用BIOPLEX數(shù)據(jù)庫預(yù)測潛在的結(jié)合蛋白，通過免疫共沉淀（co-IP）實驗驗證了僅EEF1AKMT3與RIPK1存在明顯蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（圖6A）。通過體外激酶實驗發(fā)現(xiàn)EEF1AKMT3被RIPK1蛋白磷酸化（圖6B），通過LC-MS/MS質(zhì)譜分析，確定了在搭橋動脈中EEF1AKMT3是真正的RIPK1底物，磷酸化位點在Ser26處（圖6C）。又通過翻譯表面?zhèn)鞲校⊿UnSET）實驗和體外甲基化實驗驗證了EEF1AKMT3可以通過調(diào)節(jié)翻譯相關(guān)蛋白EEF1A的K165甲基化來促進核糖體蛋白的合成途徑，最終介導(dǎo)細胞N-shh的分泌（圖6D,E）。最終，研究證明內(nèi)皮細胞RIPK1KO可以增加Shh分泌，促進SMC增殖和新內(nèi)膜的形成。圖6RIPK1通過分泌N-Shh調(diào)控血管重構(gòu)的機制研究05RIPK1-EEF1AKMT3-Hedgehog信號通路改善血管重塑通過在RIPK1cKO移植模型中局部應(yīng)用GDCO449（Sonichedgehog信號通路抑制劑），發(fā)現(xiàn)原位靶向平滑肌細胞的Sonichedgehog信號通路能夠顯著緩解內(nèi)皮細胞敲除RIPK1引發(fā)的平滑肌細胞異常增殖和搭橋動脈重構(gòu)，主要表現(xiàn)在：狹窄明顯減輕（圖7A,B），增殖SMCs減少（圖7C），炎癥因子和炎癥浸潤減少（圖7D）。圖7RIPK1-EEF1AKMT3-Hedgehog信號通路改善血管重塑綜上，該研究表明內(nèi)皮細胞RIPK1-EEF1AKMT3S26-EEF1AK165-Hedgehog信號通路通過調(diào)節(jié)核糖體蛋白合成功能，干預(yù)N-Shh分泌并參與內(nèi)皮-平滑肌細胞通訊，共同調(diào)控搭橋動脈重構(gòu)（圖8）。抑制內(nèi)皮-平滑肌細胞激活的Sonichedgehog信號通路可能是預(yù)防搭橋動脈粥樣硬化及再狹窄的新方法。圖8RIPK1對搭橋動脈血管重塑的機制探究細胞因子廣篩抗體芯片優(yōu)勢：少量樣本即可篩選大量指標(biāo)：100uL的液質(zhì)樣本即可檢測上千種細胞因子檢測指標(biāo)比傳統(tǒng)ELISA等技術(shù)更省樣本、成本和時間芯片上每種抗體設(shè)置2或4個技術(shù)重復(fù)，保證數(shù)據(jù)質(zhì)量華盈生物已經(jīng)完成多種類型的檢測，服務(wù)有保障。如：血清、血漿、細胞上清、組織上清、腦脊液、尿液、房水、淚液、玻璃體、唾液、宮腔液、宮頸刮片、關(guān)節(jié)液、肺泡灌洗液、骨髓灌洗液、齦溝液、細胞、組織、外泌體等業(yè)務(wù)咨詢400-869-2936微信同號）參考文獻：LuY,LengY,LiY,etal.EndothelialRIPK1protectsarterybypassgraftagainstarteriosclerosisbyregulatingSMCgrowth.SciAdv.2023Sep;9(35):eadh8939.相關(guān)閱讀華盈細胞因子芯片技術(shù)助力多項生物材料研究發(fā)表1區(qū)高水平文章磷酸化抗體芯片助