T-CSBM 0050.4-2024 創(chuàng)面修復材料有效性評價 第4部分：體外微血管形成試驗評價方法

T/CSBMT/CSBM0050.4—2024創(chuàng)面修復材料有效性評價第4部分：體外微血管形成試驗評價方法EffectivenessevaluationofwoundrepairmaterialsPart3:Invitromicroangiogenesisevaluationmethod中國生物材料學會發(fā)布I 3 4本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起本文件起草單位：杭州英健生物科技有限公司、中國食品藥品檢定1本文件適用于適用于創(chuàng)面修復材料促進創(chuàng)面微血2規(guī)范性引用文件T/CSBM0050.1—2024創(chuàng)面修復材料有效性評價第1部分：水溶性T/CSBM0050.2—2024創(chuàng)面修復材料有效性評價第2部分：水不溶性材料3,14樣品制備4.2水不溶性材料5血管形成試驗5.2器具、試劑和耗材、細胞系25.2.1器具m)基質(zhì)膠；5.2.2試劑和耗材b)磷酸緩沖液（PBS5.2.3細胞系5.3樣品制備5.3.1試驗樣品5.3.2空白對照MEM低糖培養(yǎng)基，37℃、120r/min搖床中震蕩25.4試驗步驟5.4.1.1細胞復蘇將EA.HY926細胞凍存管于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)不斷晃動，待細胞凍存液完全溶解，將凍存的細胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi)，隨后加入MEM低糖培養(yǎng)基，用無菌巴氏吸管吹打均勻后1000r/min離心3min。5.4.1.2細胞傳代3當細胞密度約為80％時，吸去培養(yǎng)瓶中原有的培養(yǎng)基，使用PBS輕洗兩次，加入1mL～2mL0.25%胰蛋白酶消化3min～5min，顯微鏡觀察細胞消化情況，當細胞邊緣縮小，貼壁松動時，手指輕叩細胞瓶身，肉眼可見細胞脫落，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入一定量的MEM低糖培養(yǎng)基終5mLMEM低糖培養(yǎng)基，將細胞重新混懸，取適量混勻的細胞懸液于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代比例為1：4，2天～3天5.4.1.3細胞凍存然后將混勻的細胞懸液放入凍存管中，每管1mL，凍存密度為1×105/mL～1×106/mL。凍存管上應標明5.4.2小管形成試驗d)待細胞融合至80％左右時，將細胞消化、離心并分別用試驗液和空白對照6.2小管形成試驗結(jié)果：在觀察時間內(nèi)血管形成情況的描述，并給出顯微鏡下圖片結(jié)果。6.3免疫熒光染色結(jié)果：評價血管網(wǎng)形成的數(shù)量和血管形成的總長度，采用統(tǒng)計學評價方法，評價材料促進血管形成的效果，并給出免疫熒光染色的結(jié)果圖片。經(jīng)統(tǒng)計學分析試驗組和空白對照組比較p<4A.1器具、試劑和耗材、細胞系A(chǔ).2.1浸提液制備A.2.2空白對照5MEM低糖培養(yǎng)基，37℃、120r/min搖床中震蕩24h±2h。A.3試驗步驟A.3.1EA.HY926細胞培養(yǎng)A.3.2小管形成試驗A.4血管形成試驗結(jié)果A.4.1小管形成試驗結(jié)果各組細胞分別加入處理后的樣品重懸，隨后接種到鋪板基質(zhì)膠的24孔板中培養(yǎng)9h，觀察各組血管與相鄰細胞相連；3h時，部分細胞由圓形伸展為長梭形，部分細胞間逐漸建立連接逐漸斷裂，細胞逐漸聚集，小管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量減少。×100顯微鏡下不同時間小管形成情況見A.