質粒的提取與鑒定

質粒DNA的提取和鑒定實驗目的實驗原理實驗儀器和試劑實驗步驟

一二三四注意事項思考題五

六一、實驗目的了解質粒的基本特性和其應用；掌握堿裂解法提取質粒DNA的基本原理和實驗方法。二、基本原理質粒是存在于細菌染色體之外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子；質粒具有復制起始區(qū)，能獨立自主的復制，且在細菌中的拷貝數(shù)少的有1～2個，多達10個以上；質粒具有抗生素抗性基因等，可賦予細菌相應的表型。1.質粒DNA抗生素基因：Amp多克隆位點：MCS復制起始點：ori其它：lac操縱子和lac基因2.質粒DNA-pTA2-basic和pTA2-p53pTA-p53質粒為：3956bp（p53為1179bp）3.質粒DNA的提取方法提取質粒：堿裂解法、煮沸法、氯化銫密度梯

度離心法等純化質粒DNA：酚氯仿抽提法、硅膠膜吸附法、

磁珠吸附法等質量鑒定：瓊脂糖電泳、OD值質粒DNA的提取方法堿裂解法原理：pH值介于12.0~12.5pH中性閉合環(huán)狀的質粒DNA氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互盤繞,仍會緊密地結合在一起。質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確。線性的DNA（染色體DNA）雙螺旋結構解開而被變性線性的染色體DNA兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結構。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。三、實驗儀器和試劑儀器：培養(yǎng)細菌所需：恒溫搖床、超凈臺、錐形瓶、細菌培養(yǎng)皿等提取質粒所需：高速離心機、離心管、移液器、吸頭質粒定量所需：紫外分光光度計試劑：培養(yǎng)細菌：LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、抗生素提取質粒：TAKARA公司試劑盒挑單克隆菌株接種液體培養(yǎng)液內(nèi)(含抗生素)；37℃振蕩過夜培養(yǎng)；離心后收集菌液，提取質粒四、實驗步驟1.取1.5+1.5ml菌液，12,000rpm離心2分鐘，棄上清液。2.用250μl的SolutionⅠ充分懸浮細菌沉淀。

3.加入250μl的SolutionⅡ輕輕上下翻轉混合5～6次，使菌體充分裂解。

注）輕輕顛倒混合,不可劇烈振蕩。

4.加入350μl的4℃預冷的SolutionⅢ，輕輕上下翻轉混合5～6次，室溫靜置2分鐘。

5.12,000rpm離心10分鐘，取上清液。6.將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。7.將步驟5的上清液轉移至SpinColumn中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。9.將500μl的BufferWA加入SpinColumn中，12,000rpm離心30秒，棄濾液。10.將700μl的BufferWB加入SpinColumn中，12,000rpm離心30秒鐘，棄濾液。

11.重復操作步驟10。12.重新將SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm離心1分鐘，除盡殘留洗液。

13.將SpinColumn安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinColumn膜的中央處加入30

μl的ElutionBuffer，室溫靜置1分鐘。14.12,000rpm離心1分鐘洗脫DNA。保存濾液于離心管中，即質粒。

計算A260/A280比值。

DNA濃度(μg/μl)=A260×50（稀釋倍數(shù)）×501OD260=50ug/ml雙鏈DNAOD260/OD280=1.7~1.9表示純度較好質粒DNA的定量可直接用于轉化、DNA序列分析、體外轉錄、限制酶切以及其他各種酶促反應。五、注意事項每次起始的菌液量應控制在1～4ml，菌量太大影響溶菌及質粒DNA的釋放，純化時會影響質粒DNA的純度。菌體的培養(yǎng)時間不要超過16小時，否則難以裂解。加入SolutionⅡ和SolutionⅢ后，不要劇烈混合（Vortex等），劇烈混合會導致基因組DNA的污染。加入SolutionⅢ后，應充分混合使蛋白質、基因組DNA等形成白色沉淀，離心后沉降于離心管底部。若離心后沉淀仍懸浮于