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備案號(hào)：33827-2012DB46DB46/T220—2012檳榔苗黃化病植原體PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范TechnicalspecificationforPCRdetectionofarecanutyellowleafphytoplasmaofseedling海南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速在12000rpm以上）、全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)、PCR儀、2稱取抽樣的檳榔植株剛抽出的心葉0.5g，加入適量液氮研磨呈粉狀，再加入1mLDNA提取緩沖液min；加入等體積氯仿：異戊醇（24：1）混勻，4℃6000rpm離心5mi上清液，加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇（2），引物序列5’-3’PCR反應(yīng)條件為：94℃,預(yù)變性2min；94℃變性1min；45℃退火45s，72℃延伸1min；共進(jìn)行30加樣量(μL）3加樣量(μL）取5μLPCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL溴化量標(biāo)準(zhǔn)，在120V電場(chǎng)強(qiáng)度下電泳約20min，最后用全自動(dòng)數(shù)將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，序列結(jié)果利用植原體分類鑒定的在線專用數(shù)據(jù)庫(kù)-iPhyClassifier（http://plantpathology.b否否是是是否否是是否體否否是否-否否否--否是---是----4引物/探針序列5’-3’TaqManUniversalRCRMast否否是是是否否是是否否否是否 否否否--否是 是----5TaqDNA聚合酶、10×PCR緩沖液、dNTP液（2.5mmol/LdATA.3緩沖液稱取186.1gNa2?EDTA?2H2O，置于1L燒杯中，加入約800mlNaCl，充分?jǐn)嚢?，用去離子水將溶液定容至100A.3.6TAE電泳緩沖液（50×)（pH約86

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