SN∕T 3731.4-2017 食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第4部分：火雞成分檢測實(shí)時(shí)熒光PCR法

中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)代替SN/T3731.4—2013食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法第4部分：火雞成分檢測實(shí)時(shí)熒光PCR法I——第3部分：鴿子成分檢測實(shí)時(shí)熒光PCR法； 本部分為SN/T3731的第4部分。—-SN/T3731.4—21實(shí)時(shí)熒光PCR法2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測屬雉科(Phasianidae)火雞屬(Meleagris),學(xué)名Meleagrisgallopavo。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCRPCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReactiDNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonuleicdNTP:脫氧核苷酸三磷酸(DeoxyribonucleosideTriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(EthyleneDiaminetetraa26.1檢測用引物和探針序列(5'-3)目的基因火雞12SrRNA基因6.2試劑6.2.3蛋白酶K溶液(20mg/mL)6.2.770%乙醇。6.2.8TE緩沖液(Tris-Cl、EDTA緩沖液):10mmol/ITris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA0.2mmol/L～0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料(某些熒光PCR儀不需要ROX校正)。如果7.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀。37.6研缽及粉碎裝置。7.7渦旋振蕩器8檢驗(yàn)步驟8.1DNA提取將樣品研磨后，稱取200mg左右固體樣品或200pl液體樣都于2mL離心管中，加入1.5mLCTAB提取緩沖液和10pL蛋白酶K溶液。60℃振蕩過夜后13000g離心10min,轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中。加入750μL氯仿后用力振蕩，13000g離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入2倍體積的CTAB沉淀溶液，室溫靜置60min13000g離心Ismin,棄去上清液。加入350pLNaCl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮。再加入350μL氯仿，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13000g離心10min。轉(zhuǎn)移上清液后加入0.6倍體積的異丙醇用來沉淀核酸，室溫放置20min,13000g離心10min,棄去上清液。加入500μL70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于200pLTE溶液中。立即使用或-20℃保存?zhèn)溆?。也可用等效的DNA提取方法提取模板DNA。8.2DNA濃度和純度的測定使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)2z6和Az?。DNA的濃度按照式(1)計(jì)算，當(dāng)Azoo/A比值在1/4~1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增：c=AXN×50/1000A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。8.3實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增8.3.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件隨儀器不同略有改變，一般為：50℃2min;95℃10min;95℃15s,60℃1min,40個(gè)循環(huán)。8.3.3每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行的反應(yīng)體系。檢測過程中應(yīng)分別設(shè)立陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。用已知含火雞成分的樣品作陽性對(duì)照，用已知不含火雞成分的樣品作陰性對(duì)照，用等體積的雙蒸水代替9質(zhì)量控制以下條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無效：a)空白對(duì)照：無熒光對(duì)數(shù)增長，相應(yīng)的Ct值=40.0;