T-CVMA 156-2024 豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬丁型冠狀病毒的三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法

T/CVMA156—2024豬丁型冠狀病毒的三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法Atriplereal-timeRT-PCRmethodfordetectionofporcinediarrheavirus,porcinetransmissiblegastroenteritisvirus,andporcinedeltacoronavirus2024-5-8發(fā)布2024-5-8實(shí)施中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布I1豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和檢測(cè)方法的試劑和材料、儀器設(shè)備、樣品的采集與處理、操作方2規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范4符號(hào)和縮略語reaction）BHQ：無熒光淬滅基團(tuán)（Blackholequencher）Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（CyMGB：小溝結(jié)合物（MinorgroovebindePEDV：豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus）2RNA：核糖核苷酸（Ribonucleicacid）TGEV：豬傳染性胃腸炎病毒（Tran5試劑和耗材5.1試劑）：5.1.7商品化熒光RT-PCR試劑盒：含一步法熒光R5.1.8陽性對(duì)照：重組質(zhì)粒，制備過程見附錄三重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增用上、下游引物和探針序列見附6儀器與設(shè)備6.5冰箱，儲(chǔ)藏溫度在2℃~8℃和?20℃以下。3采集充血、出血、腸壁變薄、含多量水樣糞便等病變明顯的小腸組織。用無菌剪刀剪取約0.5cm酸。如在2h內(nèi)檢測(cè)可將提取的核酸置于冰上保存，超過2h對(duì)應(yīng)的樣品編號(hào)。蓋緊管蓋后，500g離心30三個(gè)熒光通道，F(xiàn)AM對(duì)應(yīng)淬滅基團(tuán)選擇MGB，其余均選擇無（None）熒光。在熒光PCR儀上進(jìn)行9結(jié)果判定49.1結(jié)果分析條件設(shè)定9.2試驗(yàn)成立的條件>40，且無特異性擴(kuò)增曲線，Cy5通道無Ct值或Ct值＞40，且無特異性擴(kuò)增曲線。9.2.39.2.1和9.2.2要求需在同一次試驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次試驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。9.3結(jié)果描述及判定若被檢樣品在相應(yīng)通道Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為相應(yīng)病原核酸陽性。FAM通道光信號(hào)表示PDCoV核酸陽性。只有一種陽性熒光信號(hào)為單陽性；兩種陽性熒光信號(hào)表示對(duì)應(yīng)的其中9.3.3可疑重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Ct值≤40且有明顯擴(kuò)增曲線則判為相應(yīng)病原核酸陽性，否則判為相應(yīng)病原核5溶液配制A.1DEPC水），A.20.01mol/LPBA.3拭子懸液），A.4組織懸液6ATGCGCCGTGGTGAGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGAGAGTAGACTCCTTGCAGGGATTATGGATCCAATGGGTACATGGAGGTGCATTCCCATCGACCACATGGCTCCAATTCTCACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCCAATTTTAATTCTGCTGAAGGTGCTATTATATGCATTTGCAAGGGCTCACCACCTACTACCACCACAGAATCTAGTTTGACTTGCAATTGGGGTAGTGAGTGCAGGTTAAACCATAAGTTCCCTATATGTCCTTCTAATTCAGAGGCAAATTGTGGTAATATGCTGGenBankAccessionNo.KU981059.1為TGEV陽性序列（JS2012株，GenBankAccessionNo.K利用超微量分光光度計(jì)測(cè)定陽性重組質(zhì)粒濃度，并按下面公式將濃度換算成拷貝數(shù)，DNA拷貝/μL=[6.02×1023×DNA濃度(ng/μL)×10-9]/(DNA堿基數(shù)×660)。作為陽性對(duì)照時(shí)，選取濃度為104拷貝/μL。7N基因FAM-AACCTTCCAATTGGC-MGBTCTGCTGAAGGTGCTATTATGEV-RHEX-YAAGGGCTCACCACCTACTACCACCA-BHQ1PDCoV-FPDCoV-RPDCoV-PCy5-AATGCACCTCCATGTACC-BHQ2注：簡(jiǎn)并堿基Y代表C/T，引物和探針可由生物公司合成，純度為HPLC