DB3717T 23-2024植物種苗組培技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB053717DB3717/T23—20242024-06-28發(fā)布2024-07-28實施IDB3717/T23—2024前言 II 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4培養(yǎng)基的配制 4.1母液的配制 4.2植物接種培養(yǎng)基 5植物材料的選擇與外植體滅菌 5.1植物組培苗外植體母本圃種植 5.2植物材料選擇時間 5.3植物材料部位的確定和選擇 5.4儀器和植物外植體材料的滅菌 5.5儀器及培養(yǎng)基的最少消毒時間 5.6儀器和培養(yǎng)基與外植體消毒 5.7植物外植體的無菌操作 6組織培養(yǎng)苗試管培養(yǎng) 6.1愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng) 6.2增殖繼代培養(yǎng) 6.3植物組織生根培養(yǎng) 6.4組織苗煉苗移栽 6.5移栽穴盤苗的管理 7包裝與運輸 附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基母液配制 附錄B（規(guī)范性）不同植物品種常用培養(yǎng)基配法 附錄C（規(guī)范性）生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制 附錄D（規(guī)范性）植物不同器官消毒順序 附錄E（規(guī)范性）器皿及培養(yǎng)基的最少滅菌時間 附錄F（規(guī)范性）儀器和培養(yǎng)基的消毒壓力和溫度與排氣的關(guān)系 附錄G（規(guī)范性）植物外植體材料的滅菌常用消毒劑效果 附錄H（規(guī)范性）ABT生根粉種類及使用濃度 8附錄I（規(guī)范性）不同植物激素種類與使用濃度 IIDB3717/T23—2024本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由菏澤市林業(yè)局提出、歸口并組織實施。本文件起草單位：菏澤市林業(yè)科學(xué)研究院、菏澤市林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心、菏澤市自然資源和規(guī)劃局、菏澤市行政審批踏勘評審中心、菏澤林業(yè)技術(shù)服務(wù)中心、鄆城縣陽光花卉有限公司。本文件主要起草人：袁全國﹑王金國﹑任升﹑李艷玲﹑陳和平、晁新勝﹑羅松﹑李新艷﹑劉金錦﹑王海燕﹑蘇麗娟﹑張淼﹑王傳印﹑左傳偵。1DB3717/T23—2024植物種苗組培技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了植物種苗組培的術(shù)語和定義、培養(yǎng)基配制、接種操作流程、包裝和運輸。本文件適用于菏澤市植物種苗的組培。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T1965-2003日光溫室和塑料大棚結(jié)構(gòu)與性能要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。種苗germchit種子播種發(fā)芽后，一般生長到2對真葉，適合移植到其它環(huán)境生長的幼小植株。利用植物器官、組織、細胞、原生質(zhì)體，在無菌和適宜的人工條件下，培育植株。4培養(yǎng)基的配制4.1母液的配制4.1.1MS培養(yǎng)基母液的配制培養(yǎng)基母液配制參見附錄A。不同植物品種常用培養(yǎng)基配制方法見附錄B。配制好的母液瓶上分別貼上標(biāo)簽，注明母液號﹑配制倍數(shù)﹑日期及配制1L培養(yǎng)基時應(yīng)取的量。定容后貯藏于冰箱中保存?zhèn)溆谩?.1.2生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制見附錄C，定容后貯藏于冰箱中保存?zhèn)溆?，若貯藏時間過長，發(fā)生乳析現(xiàn)象應(yīng)震蕩均勻后使用。4.2植物接種培養(yǎng)基2DB3717/T23—20244.2.1.1先將貯藏的母液依次按順序擺放好,再準(zhǔn)備好各種玻璃器皿﹑量筒﹑燒杯﹑吸管﹑玻璃棒﹑漏斗等。稱好瓊脂﹑蔗糖，配好生長調(diào)節(jié)劑。準(zhǔn)備好蒸餾水和封瓶口用的繩子﹑封口紙。4.2.1.2根據(jù)培養(yǎng)基的配方分別用吸管吸取培養(yǎng)基母液，把依母液的濃度量取規(guī)定量滴入量筒中。加完母液依培養(yǎng)基的配方計算出所需生長調(diào)節(jié)劑的量，吸取滴入量筒中，定容到1000ml所需的體積。把定容的培養(yǎng)基液倒入含有0.6%～1.0%瓊脂﹑1%～5%蔗糖的加熱容器內(nèi)繼續(xù)加熱，不斷攪拌，直至使瓊脂完全溶解。趁熱分裝培養(yǎng)基，一般占試管、三角瓶等容器1/3～1/4左右為宜。注意避免培養(yǎng)基粘到瓶壁上，防止感染雜菌。分裝好的培養(yǎng)基、無菌水、接種工具放入高壓消毒鍋中(滅菌壓力0.11MPa～0.14MPa,120℃~126℃,15min～20min)，不要裝入太滿影響蒸汽循環(huán)。高壓滅菌后培養(yǎng)基取出，放置凝固后接種使用。5植物材料的選擇與外植體滅菌5.1植物組培苗外植體母本圃種植將性狀優(yōu)良的組培苗種植在溫室內(nèi),加強水肥管理,使植株生長健壯,減少植物體表面的細菌﹑真菌﹑微生物的數(shù)量。5.2植物材料選擇時間3月植物外植體形成愈傷組織最多，7月次之，最次12月愈傷組織形成最少，確定最佳時間為3月份。5.3植物材料部位的確定和選擇根據(jù)組織培育目的，可選擇根﹑莖﹑葉等組織和器官，一般選擇植物的莖段作為植物培育外植體。5.4植物不同器官滅菌順序見附件D。5.5儀器及培養(yǎng)基的最少消毒時間見附錄E。器皿和金屬器械滅菌采用高溫高壓蒸汽滅菌法，器皿、金屬器械和培養(yǎng)基的最少滅菌時間參見附錄。5.6儀器﹑培養(yǎng)基與外植體消毒5.6.1儀器﹑培養(yǎng)基的消毒壓力和溫度與排氣的關(guān)系見附錄F。5.6.2植物外植體材料的滅菌常用消毒劑效果見附錄G。3DB3717/T23—20245.6.3無菌室的滅菌接種前一天,高錳酸鉀與甲醛混合產(chǎn)生的霧化氣體封閉無菌室滅菌，并紫外燈照射30min。5.7植物外植體的無菌操作植物組織的整個接種過程均需無菌操作。將滅菌沖洗干凈的嫩梢0.5cm～1cm小段放在超凈工作臺無菌的環(huán)境中,用左手鑷子夾住莖尖,右手用解剖刀除去幼芽的外面部分,切取頂端0.5mm～1mm大小的芽接種在滅菌的培養(yǎng)基中進行愈傷組織分化培養(yǎng)，可將病毒除去。6組織培養(yǎng)苗試管培養(yǎng)6.1愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)每天12h光照。（不同植物激素使用種類與濃度見附錄H）。6.2增殖繼代培養(yǎng)瓊脂,pH值為6.0左右的培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng),經(jīng)2-4周器官分化,形成纖弱小芽。瓊脂,pH值為6.0左右的培養(yǎng)基上,用于壯苗。隨著繼代增殖培養(yǎng)逐漸減少6-BA的用量，最后一次繼代增殖培養(yǎng)可以加少量的IAA﹑NAA﹑IBA便于外植體的復(fù)壯與生根。6.3植物組織生根培養(yǎng)蔗糖+0.7%瓊脂,PH值6.0左右的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～40天,基部切口處產(chǎn)生新根。6.4組織苗煉苗移栽6.4.1當(dāng)組培苗新根長至1㎝～5㎝,苗高5cm～8cm時,培養(yǎng)瓶內(nèi)加入少量無菌水,轉(zhuǎn)移到23℃~25℃的溫室中接受自然光的照射，3天～6天后取出試管,無菌蒸餾水沖干凈黏附在根部的瓊脂。6.4.2將清洗干凈的試管苗在50%可濕性粉劑多菌靈30～70倍液與ABT生根劑液中浸泡（ABT生根粉種類與濃度見附錄I定植在混合基質(zhì)中，混合基質(zhì)配方是泥炭：蛭石：珍珠巖（2：1：1）。注意覆蓋小拱棚及遮陰網(wǎng)，避強光且保濕；移栽前試管苗澆灌0.5g/L的多菌靈溶液進行基質(zhì)消毒。6.5移栽穴盤苗的管理10%MS培養(yǎng)基澆灌。每3天噴施稀釋1000～1500倍的多菌靈或百菌清等殺菌劑一次。7包裝與運輸4DB3717/T23—2024試管苗及穴盤苗包裝:將代有試管的組培苗裝在泡沫箱里,外面在用紙箱包裝；穴盤苗連同穴盤放在紙箱里，層層放置，保持立體空間。每箱貼上標(biāo)簽,注明品種﹑等級﹑規(guī)格﹑數(shù)量、產(chǎn)地等放在托盤上運輸。及時冷藏運輸,避免極端天氣。5DB3717/T23—2024附錄A培養(yǎng)基母液配制培養(yǎng)基母液配置見表A.1。表1.1培養(yǎng)基母液配置KNO?NH4NO?MgSO4·7H2OCaCl2·2H2OMnSO4·4H2OZnSO4·7H2OMnSO4·4H2OZnSO4·7H2OIKNa2MoO4·2H2OCuSO4·5H2ONa2-EDTA----5----6DB3717/T23—2024附錄B不同植物品種常用培養(yǎng)基配法不同植物品種常用培養(yǎng)基配法見表B.1。表1.2不同植物品種常用培養(yǎng)基配法MS+6-BA1.0mg/L+KT0.2mg/LMS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L馨MS+6-BA0.5mg/L+2·4-D1mg/LMS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/LMS+6-BA0.5mg/L+KT2.0mg/LMS+6-BA0.5mg/L+GA35mg/L星MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/LMS+6-BA2.0mg/L+KT0.5mg/L桃MS+6-BA3.0mg/L+KT0.5mg/LMS+IBA0.5mg/L+ZT2.0mMS+ZT2.0+NAA0.5mg/L+IAA0.5mg/LMS+NAA2.0mg/L+IAA0.5mgMS+6-BA0.1mg/L+KT0.5mg/LMS+6-BA0.1mg/L+IBA0.5mg/L1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.5mg/LMS+6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/LMS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.4mg/LMS+6-BA2.0mg/L+NAA2.0mg/LMS+6-BA0.5mg/L+IBA1mg/L+NAA0.5mg/L蘭7DB3717/T23—2024附錄C生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制見表C.1。表1.3生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制IAANAAKT6-BAZT8DB3717/T23—2024附錄D植物不同器官消毒順序植物不同器官消毒順序見表D.1。表1.4植物不同器官消毒順序9DB3717/T23—2024附錄E儀器和培養(yǎng)基的最少滅菌時間儀器和培養(yǎng)基的最少滅菌時間見表E.1。表1.5儀器和培養(yǎng)基的最少滅菌時間DB3717/T23—2024儀器﹑培養(yǎng)基的消毒壓力和溫度與排氣的關(guān)系儀器﹑培養(yǎng)基的壓力和溫度與排氣的關(guān)系見表F.1。表1.6儀器﹑培養(yǎng)基的壓力和溫度與排氣的關(guān)系2/3排除5DB3717/T23—2024附錄G植物外植體常用消毒劑效果植物外植體常用消毒劑效果見表G.1。表1.7植物外植體常用消毒劑效果易2易好