GB∕ T 40447-2021 鴨茅蜜穗病菌檢疫鑒定方法（正式版）

國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準化管理委員會IGB/T40447—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國植物檢疫標(biāo)準化技術(shù)委員會(SAC/TC271)提出并歸口。大學(xué)。1GB/T40447—2021鴨茅蜜穗病菌檢疫鑒定方法本文件描述了鴨茅蜜穗病菌的癥狀觀察、分離培養(yǎng)及分子生物學(xué)等檢疫鑒定方法。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SN/T2122進出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣方法本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。Krasil'nikov1949;Agrobacteriumrathayi(Smith1913)Savulescu1947;Corynebacteriumrathayi(Smith1913)Dowson1942;Erwiniarathayi(Smith1913)Grametal.1929;Phytomonasrathayi(Smith1913)Bergeyetal.1923;Bacteriumrathayi(Smith1913)Aujeszky1914;AplanobacterrathayiSmith1913。分類地位：病菌屬細菌域Bacteria,放線菌門Actinobacteria,放線菌綱Actinobacteria,放線菌目Actinomycetales,微桿菌科Microbacteriaceae,拉氏桿菌屬Rathayibacter。鴨茅蜜穗病菌的其他基本信息參見附錄A。5方法原理根據(jù)鴨茅蜜穗病菌的為害癥狀、培養(yǎng)性狀和生理生化特性對病原菌進行分離培養(yǎng)及致病性測試，根據(jù)鴨茅蜜穗病菌的特異性DNA序列進行分子生物學(xué)檢測。生物鑒定系統(tǒng)等。2GB/T40447—20217主要試劑70%乙醇，1%次氯酸鈉，生理鹽水，3%氫氧化鉀(KOH)。BHI、BHIA和D2NAX培養(yǎng)基配方按照附錄B執(zhí)行。實時熒光PCR檢測試劑按照附錄C的C.1、C.2執(zhí)行。8檢疫鑒定流程檢測樣品的鴨茅蜜穗病菌檢疫鑒定步驟按圖1進行。檢測樣品檢測樣品陽性陰性陽性陰性陽性陰性致病性測試陽性未檢出9檢疫鑒定方法現(xiàn)場檢疫中，如植株樣品發(fā)現(xiàn)疑似癥狀(參見A.4),取樣帶回實驗室作進一步顯微鏡檢查和病菌分離鑒定。種子樣品進行隔離種植觀察或病菌直接分離鑒定。取樣方法按照SN/T2122執(zhí)行。取種子樣品100g,置于1%次氯酸鈉溶液中表面消毒10min;無菌水洗滌3次后加入200mL無菌浸出液?？扇〔糠纸鲆弘x心沉淀提取DNA進行PCR初檢，部分浸出液用于分離培養(yǎng)。3GB/T40447—2021疑似菌落培養(yǎng)3d～5d后轉(zhuǎn)移至BHI平板上培養(yǎng)2d～3d進行純化，純化3次后進行實時熒光取病健交界處植株組織，切成5mm×5mm小塊，70%乙醇表面消毒60s,無菌水清洗3次后移至淀提取DNA,進行PCR初檢，部分組織處理液在D2ANX平板上劃線分離，劃線5個～10個平板，3次后進行實時熒光PCR、生理生化鑒定等后續(xù)試驗。9.3實時熒光PCR檢測疑似分離物純化后提取DNA,進行實時熒光PCR檢測，檢測方法疑似分離物用革蘭氏染色法或KOH反應(yīng)法進行革蘭氏陰陽性判定。取3%KOH溶液1滴，滴在用BIOLOG鑒定系統(tǒng)(GENⅢ)或細菌微量生化鑒定管對上述判定為革蘭氏陽性的疑似分離物進行相關(guān)生理生化指標(biāo)測定。疑似分離物轉(zhuǎn)移至BHI平板上26℃培養(yǎng)2d,取菌落用無菌水配成10?CFU/mL菌懸液，針刺法接種5株～10株寄主幼苗葉片，接種后放置于26℃~28℃光照培養(yǎng)箱中，在相對濕度80%,光暗比例為16:8的條件下培養(yǎng)，7d后觀察是否有癥狀產(chǎn)生。陽性分離物接種后，植物可在2周內(nèi)出現(xiàn)典型癥按9.2分離到的疑似分離物在培養(yǎng)基上的菌落特征符合9.2.2特征，生理生化特征符合9.4陽性，實時熒光PCR檢測結(jié)果符合C.2.4陽性判定，且致病性測試為陽性時，判定為檢出鴨茅蜜穗病菌。否則判定為未檢出鴨茅蜜穗病菌。11樣品及檢測結(jié)果保存陽性樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后妥善保存6個月以上。保存期滿后應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后方可處理。4GB/T40447—202111.2菌株保存與處理分離并鑒定為鴨茅蜜穗病菌菌株，應(yīng)妥善保存。可用甘油冷凍保存法或凍干保存法保存。對不需要長期保存的其他菌株應(yīng)及時滅菌處理。5GB/T40447—2021(資料性)鴨茅蜜穗病菌其他信息A.1分布A.2寄主范圍自然寄主是鴨茅草(Dactylisglamerata)、狗芽根草(Cynodondactylon)、多花黑麥草(Loliummultiflorum)、瑞士黑麥草(L.rigidum)、黑麥(Secalecereale);利用人工接種可侵染小麥屬植物，普通小麥(Triticumaestivum)、二粒小麥(T.dicoccum)、硬小麥(T.durum)A.3生物學(xué)特性養(yǎng)，氧化型代謝，接觸酶陽性。對營養(yǎng)要求苛刻，需氨基酸。菌株適宜生長溫度為24℃~28℃。最高生長溫度29℃~32℃,最高耐鹽力3%。在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長緩慢且弱，菌落圓形、全緣、光滑、凸A.4侵染循環(huán)病菌可在種子內(nèi)越冬，潛伏期較長，通?？纱婊?個月以上，翌年播種后，侵染幼苗。病菌由氣孔及其他孔口侵入，也可通過傷口和根部侵入。寄主全部生長期內(nèi)病菌均可感染，以幼苗最易感病，幼苗感統(tǒng)阻塞，造成寄主生長衰弱。有時植株上部，特別是花序，會產(chǎn)生黃色細菌黏液，出現(xiàn)菌癭或流膠現(xiàn)象。穗和種子上可見橙黃色黏性物。該病菌在鴨茅草上的為害癥狀見圖A.1。圖A.1鴨茅草上為害癥狀(來源：/bpp/Plant_Clinic/images/orchardgrass,%20bacterialheadblight.jpg/bpp/Plant_Clinic/images/orchardgrass,%20bacterialheadblight4.jpg)6GB/T40447—2021A.5傳播方式病菌主要通過帶菌種子隨國際貿(mào)易進行遠距離傳播；小麥粒線蟲可作為傳播媒介。77(規(guī)范性)培養(yǎng)基配方B.1腦心浸出液肉湯(BHI)胰蛋白胨10.0g;氯化鈉5.0g;磷酸氫二鈉(12H?O)2.5g;葡萄糖2.0g;牛心浸出液500mL;15g～20g;pH值調(diào)至7.4±0.2,121℃高壓滅菌15min。B.3D2NAX培養(yǎng)基酵母膏2.0g;酪蛋白水解物4.0g;葡萄糖10.0g;硫酸鎂(7H?O)0.3g;氯化銨1.0g;Trizma堿1.2g;瓊脂18g;蒸餾水1000mL,121℃高壓滅菌15min后，冷卻到58(規(guī)范性)C.1DNA提取菌懸液12000r/min離心5min,棄上清。沉淀中加入TE緩沖液20mg/mL蛋白酶K30μL,混勻，37℃水浴孵育1h。加入等體積的三氯甲烷-異戊醇(24:1),混勻。12000r/min離心5min,將上清液移至一個新離心管中。加入等體積酚-三氯甲烷-異戊醇(25:24:1),混勻，12000r/min離心5min,將上清液移至一新離心管。加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，C.2實時熒光PCR檢測表C.1引物和探針序列名稱引物/探針序列(5'-3′)引物Rr-Fcctatgcgaacacgatcaaca引物Rr-RggttctcgtccttctccctgaFAM-cctcgctggtcaaccgttacg-TAMRAC.2.2PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系(表C.2)應(yīng)先在試劑準備間進行PCR反應(yīng)體系的配制和分裝，然后移至加樣間順次加入陰性對照、樣品、陽性對照的模板DNA溶液和水(試劑空白),以防止DNA模板的交叉污染。表C.2實時熒光PCR反應(yīng)體系試劑名稱反應(yīng)體系/μLMIXbuffer探針(10pmol/μL)正向引物(20pmol/μL)反向引物(20pmol/μL)ddH?O9GB/T40447—2021C.2.3反應(yīng)參數(shù)注：可根據(jù)不同儀器/試劑盒要求將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。量2倍～10倍再次測試，出現(xiàn)典型擴增曲線，且Ct值≤35,判定為陽性；其余情況判定為GB/T40447—2021[1]AldermanSC,OcambCM,MellbyeME.QuantitativeassessmentofAnguinasp.andRathayibacterrathayiinDactylisglomerataseedproductionfieldsinOregonandestimatesofyieldloss.PlantDisease,2005,89(12):1313-1316.Applied&.EnvironmentalMicrobiolo[3]MurrayTD,SchroederBK,SchneiderWL,etal.RathayibactRathayibacterspeciesinducingBacterialHeadBlightofGrassesandthePotentialforLivestockPoi-sonings.Phytopatholog[4]Rathayibacterrathayi.2002./taxon/CORBRAnov.,nom.rev.isolatedfromwesternwheatgrass(Pascopyrums