GB∕ T 40457-2021 咖啡漿果炭疽病菌檢疫鑒定方法（正式版）

ICSCCS65.020.01咖啡漿果炭疽病菌檢疫鑒定方法國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T40457—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由全國植物檢疫標準化技術(shù)委員會(SAC/TC271)提出并歸口。1GB/T40457—2021咖啡漿果炭疽病菌檢疫鑒定方法1范圍本文件描述了咖啡漿果炭疽病菌形態(tài)學和分子生物學特征的鑒定檢測方法。本文件適用于攜帶咖啡漿果炭疽病菌的植物及其產(chǎn)品中咖啡漿果炭疽病菌的檢測。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義4分類信息分類地位：真菌界(Fungi),子囊菌門(Ascomycota),盤菌亞門(Pezizomycotina),糞殼菌綱(Sordar-iomycetes),肉座菌亞綱(Hypocreomycetidae),小叢殼目(Glomerellales),小叢殼科(Glomerellaceae),刺盤孢屬(Colletotrichum)。5鑒定原理態(tài)特征和實時熒光PCR特異性反應進行鑒定。6.2試劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液(2%CTAB,1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA,2GB/T40457—2021麥芽汁培養(yǎng)基(MEA):麥芽汁20g,蛋白胨3g,瓊脂20g,加蒸餾水配制1L。配成溶液后121℃下滅菌20min。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂粉20g,加蒸餾水配制1L。配成溶液后121℃下滅菌20min。切取發(fā)病材料病健交界處的植物組織(約0.3cm×0.3cm),用75%乙醇浸泡1min進行表面消毒，無菌水沖洗3次后置于滅菌濾紙上，吸干水分后放置于倒有麥芽汁培養(yǎng)基(MEA)的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿放置在溫度為25℃條件下光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光照和黑暗各12h交替)。培養(yǎng)4d～6d后，挑取可疑菌落邊緣的菌絲進行純化培養(yǎng)。7.2形態(tài)學觀察況等(見圖A.2)。7.3DNA制備DNA制備按照附錄B的方法提取。7.4DNA純度與濃度的測定用紫外分光光度計測定DNA的純度與濃度，分別讀取260nm和280nm處的吸收值，計為OD??o、OD?8o。DNA的純度OD?o/OD?so比值應為1.7～1.9,DNA的濃度為50倍的OD??o(μg/mL)。DNA的濃度與純度應符合實時熒光聚合酶鏈式反應(Real-timePCR)檢測的要求。7.5實時熒光PCR檢測實時熒光聚合酶鏈式反應(Real-timePCR)方法按照附錄C的方法檢測。8鑒定特征狀物。病葉上可見褐色炭疽狀病斑，其上有許多黑色小點(病原菌的分生孢子)排列成同心輪紋(見在溫度為25℃下，咖啡漿果炭疽菌培養(yǎng)物在2%麥芽汁培養(yǎng)基(MEA)平板上生長7d后，菌落直3GB/T40457—20218.3實時熒光PCR鑒定——樣品Ct值大于40時，判定為陰性。9結(jié)果判定若癥狀明顯符合8.1鑒定特征，且培養(yǎng)物培養(yǎng)特征符合8.2鑒定特征，判定為檢出咖啡漿果炭疽病菌。出咖啡漿果炭疽病菌。保存樣品應置于2℃~8℃冰箱妥善保存，對檢出咖啡漿果炭疽病菌的樣品應至少保存6個月。菌株保存于4℃冷藏箱，核酸樣品保存于-20℃或-80℃冰箱。以備復檢、談判和仲裁。分離到的咖啡漿果炭疽病菌應接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中妥善保存。熒光PCR要有檢測陽性結(jié)果照片。由指定的單位或人員負責，主要考察試驗原始數(shù)據(jù)記錄及實時熒光PCR結(jié)果等資料的完整性和真4GB/T40457—2021(資料性)咖啡漿果炭疽病菌基本信息A.1地理分布A.3傳播途徑植株相關(guān)貿(mào)易進行傳播。A.4危害情況咖啡漿果炭疽病是一種毀滅性的病害，主要危害小粒種咖啡的綠色漿果和葉片，極易造成果實脫落，并可使咖啡果實產(chǎn)量損失50%～80%。漿果表面初時呈現(xiàn)近圓形水漬狀小斑點，后病斑變成凹陷，暗褐色至灰黑色大病斑，其上長出粉紅色黏液狀物(見圖A.1)。圖A.1咖啡漿果炭疽病菌危害咖啡葉片和漿果的病害癥狀(引自Walleretal.1993)A.5形態(tài)特征咖啡漿果炭疽病菌培養(yǎng)物形態(tài)特征圖見圖A.2。5GB/T40457—20216(規(guī)范性)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取DNA方法(24:1),顛倒混勻后靜置至其開始分層。B.6可重復B.4至B.5步2次～3次，視兩相界面處雜質(zhì)的多少而定。B.12加50μL無菌水或三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(TrisEDTA,TE)緩沖液[配方：1mol/LTris-HCl(pH8.0)1mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL,加超純水定容至100mL]溶解沉淀，—20℃貯存?zhèn)溆?。GB/T40457—2021(規(guī)范性)正向引物CK-GF:5'-CTGCATCTGGTAGACAAGAAGGT-3'。反向引物CK-GR:5'-AGAGCGAGTCAGTAAATGTGACAG-3'。探針CK-GP:5'-CCCATGATTTCAATTCACATCAAGTCAAG-3'。TaqMan探針(CK-GP)采用5′末端FAM(6-carboxy-fluorescein)標記作為熒光報告染料，3'末端TAMRA(6-carboxy-tetramethhylrhodamine)標記作為熒光淬滅染料。應體系混合均勻后置于熒光PCR儀中進行反應。以咖啡漿果炭疽病菌DNA作陽性對照、不含咖啡漿果炭疽病菌的DNA作陰性對照、以無菌蒸餾水作空白對照，每個樣品設(shè)置3個重復。[1]CaiL,HydeKD,TaylorPWJ,WeirBS,WallerJ,AbangMM,ZhangJZ,YangPhoulivongS,LiuZY,PrihastutiH,ShivasRG,McKenzieEHC,JohnstonPR(2009)ApolyphasicapproachforstudyingColletotrichum.FungalDiver[2]CannonPF,DammU,JohnstonPR,WeirBS(20turedirections.StudMycol73:181-213.[3]LiuF,WeirB,DammU,CrousPW,WangY,LiuB,WangM,ZhangM,CaiL(2015).UnravellingColletotrichumspeciesassociatedwithCamellia:employingApMatandGSloresolvespeciesintheC.gloeosporioidescomplex.Persoonia35:63-86.[4]PrihastutiH,CaiL,ChenH,HydeKD(2009)CharacterizationofColletotrichumspeciesassociatedwithcoffeeberriesinChiangMai,Thailand.FungalDivers39:89-109.[5]SantamariaJ,BaymanP(2005)Fungalepiphytesandendophytesofcoffeeleaves(Coffeaarabica).MicrobEcol50:1-8.[6]SilvaDN,TalhinhasP,VarzeaV,CaiL,PauloOS,BatistaD(2012)ApplicationoftheApn2/MATlocustoimprovethesystematicsoftheColletotrichumgloeosporioidescomplex:anex-amplefromcoffee(Coffeaspp.)hosts.Mycologia104:396-409.[7]SreenivasaprasadS,BrownAE,MillsPR(1993)CoffeeBerryDiseasepathogeninAfr995-1000.[8]TaoG,HydeKD,CaiL(2012)Species-specificreal-timePCRdetectionofColletotrichumkahawae.JApplMicrobiol114(3):828-835.[9]WallerJW,BridgePD,BlackR,HakizaG(1993)Characterizationofthecoffeeberrydiseasepathogens,Colletotr