2.2.3動(dòng)物細(xì)胞的融合與單克隆抗體

2002年１２月３０日，

兩場籌備了10年的“太空婚禮”首次在神舟四號(hào)飛船上舉行，植物細(xì)胞“新人”—黃花煙草和革新一號(hào)煙草葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體，動(dòng)物細(xì)胞“新人”是小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，兩批新人同時(shí)在“產(chǎn)房”—電融合儀內(nèi)孕育新生命。一段時(shí)間后，我國首批”太空娃娃”終于順利誕生。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞融合率大大提高。一、課堂導(dǎo)入“太空婚禮”“太空婚禮”科研項(xiàng)目一：“太空婚禮”科研項(xiàng)目二：

挑戰(zhàn)自我植物體細(xì)胞雜交技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞脫分化再分化愈傷組織雜種植株溫故知新:植物體細(xì)胞雜交過程二、自主學(xué)習(xí)1.單克隆抗體的制備和應(yīng)用2.單克隆抗體的制備過程3.動(dòng)物融合的過程植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株思考：1、動(dòng)物細(xì)胞融合的概念是什么？2、動(dòng)植物細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上有何區(qū)別？這對(duì)它們雜交或融合過程有什么影響？3、植物體細(xì)胞雜交誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的方法有哪些？那動(dòng)物細(xì)胞融合呢？4、動(dòng)物細(xì)胞融合與植物原生質(zhì)體融合的基本原理是否相同？是什么原理？5、動(dòng)物細(xì)胞融合有什么意義？主要應(yīng)用在哪些方面？三、講練結(jié)合（一）、動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞A動(dòng)物細(xì)胞B誘導(dǎo)、融合雜合的細(xì)胞有絲分裂2個(gè)完整的雜交細(xì)胞AB討論：6、植物體細(xì)胞雜交可得到雜種植株，動(dòng)物細(xì)胞融合后能象電影上一樣形成雜種動(dòng)物個(gè)體嗎?為什么？植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株

1970年，有兩位科學(xué)家做了一個(gè)著名的實(shí)驗(yàn)：人—鼠細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)，以證明細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子是運(yùn)動(dòng)的。人—鼠細(xì)胞是怎樣實(shí)現(xiàn)融合的？動(dòng)物細(xì)胞融合有什么實(shí)踐意義呢？一、動(dòng)物細(xì)胞融合1.細(xì)胞融合：是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞融合為一個(gè)細(xì)胞的過程。⑴自然發(fā)生：

受精卵⑵人工誘導(dǎo)：

利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合

誘導(dǎo)因素：聚乙二醇、滅活的病毒或電激等。

鼠細(xì)胞人細(xì)胞人工誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞仙臺(tái)病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）①什么是病毒的滅活？滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。②滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。因?yàn)闇缁畹牟《灸苁辜?xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性）正在融合的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞正在融合的雞血細(xì)胞⑶動(dòng)物細(xì)胞融合的原理：細(xì)胞膜的流動(dòng)性

把兩個(gè)不同的動(dòng)物細(xì)胞放在一起，用滅活的病毒處理細(xì)胞，它們先發(fā)生質(zhì)融合，再出現(xiàn)核融合，進(jìn)而形成雜交細(xì)胞。融合后的雜交細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂后仍能形成兩個(gè)完整的雜交細(xì)胞細(xì)胞膜的流動(dòng)性滅活病毒、PEG、電激等融合后的細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，形成完整的雜交細(xì)胞誘導(dǎo)的手段？融合后細(xì)胞的類型？AB雜種細(xì)胞遺傳物質(zhì)有什么特點(diǎn)？三種AA、AB、BB（A、B）含兩種生物的遺傳物質(zhì)動(dòng)物細(xì)胞融合過程原理？物理法的融合效率較高,且對(duì)細(xì)胞（原生質(zhì)體）的傷害小,易操作、控制和觀察。太空中處于失重狀態(tài)，不同種細(xì)胞（原生質(zhì)體）更容易親近；為什么在太空中細(xì)胞（原生質(zhì)體）融合率會(huì)大大上升？為什么選用物理法誘導(dǎo)？2、動(dòng)物細(xì)胞融合的應(yīng)用1.突破有性雜交方法的局限,使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。2.成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等3、重要用途：制備單克隆抗體。四、合作探究比較植物、動(dòng)物細(xì)胞融合獲得雜種植株物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒

物理（離心、振蕩、電激）化學(xué)（聚乙二醇）直接誘導(dǎo)細(xì)胞融合去壁—原生質(zhì)體融合—誘導(dǎo)新壁—雜種植株細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性結(jié)果誘導(dǎo)方法步驟融合的原理動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項(xiàng)目獲得雜交細(xì)胞五、才華展示【例1】能使動(dòng)物細(xì)胞融合的特有的誘導(dǎo)因子是（）A.離心B.滅活的病毒C.電刺激D.振動(dòng)【例2】融合后的雜交細(xì)胞的遺傳物質(zhì)有何特點(diǎn)（）具有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的遺傳信息B.能無限增殖C.可形成新個(gè)體D.培養(yǎng)過程會(huì)貼壁【例3】動(dòng)物細(xì)胞融合的作用中最重要的是（）A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和B.制備單克隆抗體C.培育新物種D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞

BB初試牛刀A使用相應(yīng)的抗體檢測(cè)乙肝病毒——抗原(二)、單克隆抗體的制備

醫(yī)院一般怎樣檢測(cè)人體內(nèi)是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式圖

凡能夠引起機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)叫做抗原。1、什么是抗原？例如花粉、病菌、病毒等。有時(shí)自身的組織或細(xì)胞也會(huì)成為抗原，如癌細(xì)胞等?？乖瓫Q定簇：抗原表面具有的某些特定的化學(xué)基團(tuán)，能決定抗原特異性，是免疫細(xì)胞識(shí)別抗原的重要依據(jù)。各種抗原的決定簇?cái)?shù)目不同，同一抗原的決定簇可能有多種。

2、什么是抗體？由何種細(xì)胞產(chǎn)生？主要分布在哪里?起何作用？

當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激劑后由效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）產(chǎn)生的，并且能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白——抗體。

抗體分布于血清中，也分布于組織液及外分泌液中?？贵w與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合

抗體由何種細(xì)胞產(chǎn)生？主要分布在哪里?3、抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法：從血清中分離抗體多種漿細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)多種抗體抗原血清抗體（也稱多克隆抗體）由血清中提取的抗體是由不同淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多種抗體的混合物，可達(dá)百萬種以上，稱為多克隆抗體。特點(diǎn)：產(chǎn)量低、純度低、特異性差、反應(yīng)不夠靈敏。抗原不純抗體不純

抗原動(dòng)物體內(nèi)刺激效應(yīng)B抗體

每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一，特異性強(qiáng)的抗體。如果利用單個(gè)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖（克?。纬杉?xì)胞群，這樣的細(xì)胞群就有可能產(chǎn)生出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體——單克隆抗體。問題：怎樣獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體呢？在體外培養(yǎng)的條件下，一個(gè)B淋巴細(xì)胞能無限增殖形成細(xì)胞群嗎？什么樣的細(xì)胞能夠在體外無限增殖呢？

——腫瘤細(xì)胞！

抗體

抗原應(yīng)答抗體的不純性

動(dòng)物細(xì)胞受到抗原刺激,引起免疫反應(yīng)產(chǎn)生的球蛋白.不是自己的而又能引起免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)就是抗原.一種抗原有多種不同的決定簇,刺激的是多種B細(xì)胞,作用于不同的B細(xì)胞后,會(huì)產(chǎn)生多種抗體,這是多克隆的,故不純!

4.制備單克隆抗體的思路抗原

B細(xì)胞漿細(xì)胞抗體

刺激怎么才能得到純的抗體?

光純還不行,還要大量.怎么辦?

但，有問題:

找，什么細(xì)胞能無限繁殖呢?

思路就出來了:要想獲單一的純抗體,就必須從一個(gè)B細(xì)胞出發(fā).讓B細(xì)胞大量繁殖(克隆)就可以產(chǎn)生大量抗體了.B細(xì)胞是不能無限繁殖的.怎么辦?癌!只有癌細(xì)胞.但它不能產(chǎn)生抗體.癌細(xì)胞能無限繁殖,但不能產(chǎn)生抗體.B細(xì)胞能產(chǎn)生抗體,但不能大量繁殖.融合呀!只要將兩個(gè)細(xì)胞融合即可互補(bǔ).

5.技術(shù)思路的重點(diǎn)雜交瘤細(xì)胞

HAT篩選

McAb大量培養(yǎng)PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合免疫B

脾礦物油骨髓瘤瘤問題:在培養(yǎng)體系中,有5種細(xì)胞.B細(xì)胞、瘤細(xì)胞,和雜交細(xì)胞。我們還是拿不到McAb,怎么辦?篩選！篩出雜交瘤細(xì)胞。怎么篩?

又是一個(gè)思路問題。關(guān)鍵一步⑵如何誘導(dǎo)融合？

加入聚乙二醇（PEG）⑴如何得到B淋巴細(xì)胞？6.制備單克隆抗體的過程⑶細(xì)胞兩兩融合后，有哪些類型？B-BB-瘤(雜交瘤細(xì)胞)瘤-瘤⑷如何篩選出雜交瘤細(xì)胞？

單克隆抗體制備過程中，總共有兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，兩次篩選的原理和方法是不相同的。

①首先用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞①細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。②人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒有S途徑，可是能不斷分裂增殖。你想到篩選雜交瘤細(xì)胞的方案了么？

小資料：在培養(yǎng)液中加入氨基蝶呤，收集增殖細(xì)胞！加入氨基嘌呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的骨髓瘤細(xì)胞及其彼此融合的細(xì)胞就不能增殖，但人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜種細(xì)胞因?yàn)榭梢岳昧馨图?xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖。例：已知細(xì)胞增殖時(shí)合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細(xì)胞中盡管沒有S途徑，但能不斷分裂增殖，將兩種細(xì)胞在培養(yǎng)液中混合，加聚乙二醇促融，在培養(yǎng)液中有種細(xì)胞。加入氨基喋呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的及其彼此融合的細(xì)胞不能增殖。人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜交細(xì)胞中可利用淋巴細(xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖。從培養(yǎng)液中分離出雜交細(xì)胞。如何篩選出培養(yǎng)液中的雜交瘤細(xì)胞？5骨髓瘤細(xì)胞通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個(gè)，再由這些單細(xì)胞克隆生長，然后檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。②再篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞陽性孔方法——抗原-抗體雜交法

在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的原理和方法是不相同的。⑻如何得到大量的單克隆抗體？

體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)單克隆抗體

——化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)注射抗原效應(yīng)B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合多種雜交細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基

篩選1抗原-抗體雜交法克隆化單克隆抗體

篩選24.第一次篩選出的雜交瘤細(xì)胞為何需進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和專一抗體檢測(cè)？單克隆抗體篩選雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體外或體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)篩選骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合特異性雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系提取經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備過程：特點(diǎn)：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖特點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備注射抗原免疫7、單抗隆抗體的應(yīng)用①作為診斷試劑②定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病用于體外診斷人類和動(dòng)植物疾病及病原鑒定，純度高、特異性強(qiáng)，具有準(zhǔn)確、高效、簡易、快速的優(yōu)點(diǎn)。③用于治療疾病和運(yùn)載藥物利用同位素標(biāo)記單抗，在特定組織成像

制成生物導(dǎo)彈，將藥物定向帶到癌細(xì)胞所在的位置，在原位殺死癌細(xì)胞，療效高、副作用小。單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，并可以大量制備。用于治療疾病和運(yùn)載藥物①特異性強(qiáng)、靈敏度高

生物導(dǎo)彈——單克隆抗體＋抗癌藥物

②療效高、毒副作用小結(jié)合同位素的單抗-----生物導(dǎo)彈1、動(dòng)物細(xì)胞融合的目的中最重要的是（）

A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和

B.制備單克隆抗體

C.培育新物種

D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞2、動(dòng)物細(xì)胞融合過程中所用的誘導(dǎo)劑——滅活的病毒，抗原性和感染力的有無是（

）

A.失去抗原性，具有感染力

B.具有抗原性，也具有感染力

C.失去抗原性，也失去感染力

D.具有抗原性，失去感染力B六、課堂檢測(cè)D3、單克隆抗體是指（

）A.單個(gè)骨髓瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)