ARL6IP5基因在原發(fā)性肝癌中的生物學(xué)作用

1/1ARL6IP5基因在原發(fā)性肝癌中的生物學(xué)作用分類號：

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內(nèi)部研究生學(xué)位論文論文題目（中文）ARL6IP5基因在原發(fā)性肝癌中的生物學(xué)作用論文題目（外文）BiologicalfunctionofARL6IP5inprimarylivercancer研究生姓名胡澤楠學(xué)科、專業(yè)內(nèi)科學(xué)消化內(nèi)科學(xué)研究方向消化系腫瘤學(xué)位級別博士導(dǎo)師姓名、職稱周永寧、喬梁教授論起文止工年作月2009年12月至2012年12月論文提交日期2013年4月論文答辯日期2013年5月學(xué)位授予日期校址：

甘肅省蘭州市原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：

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本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。

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導(dǎo)師簽名：

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I英文縮寫索引縮寫英文全稱中文全稱APCallophycocyanin別藻藍(lán)蛋白APSammoniumpersulfate過硫酸銨bpbasepair堿基對BrdU5-Bromo-2’-Deoxyuridine5-溴脫氧尿嘧啶核苷BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白CFUcolonyformingunit克隆形成單位cDNAcomplementaryDNA互補(bǔ)DNAddH2Odoubledistilledwater雙蒸水DENdiethylnitrosamine二乙基亞硝胺DIH2Odeionizedwater去離子水3dH2O3rddistilledwater三蒸水DMSOdimethylsulfoxide二甲基亞砜DNAdeoxyribonucleicacid脫氧核糖核酸DPBSDulbecco’sphosphatebufferedsaline杜氏磷酸鹽緩沖液DTTdithiothreitol二硫蘇糖醇ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶聯(lián)免疫吸附測定ERKextracellularsignal-regulatedkinase細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶FACSfluorescenceactivatedcellsorting熒光激活細(xì)胞分選術(shù)IIFBSfetalbovineserum牛胎兒血清GSHglutathione谷胱甘肽HCChepatocellularcarcinoma原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌HCVhepatitisCvirus丙型肝炎病毒JFH1Japanesefulminanthepatitisclone1日本爆發(fā)性肝炎病毒1型克?。℉CV核心蛋白）JNKjunN-terminalkinase氨基末端激酶KDkiloDalton千道爾頓MAPKmitogen-activatedproteinkinase促分裂原活化蛋白激酶mRNAmessengerRNA信使RNAminminute(s)分鐘PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝膠電泳PIpropidiumiodide碘化丙啶RNAribonucleicacid核糖核酸rpmrevolutionsperminute轉(zhuǎn)/分ssecond(s)秒SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸鈉TEMEDtetramethylethylenediamine四甲基乙二胺Tristris(hydroxymethyl)aminomethane三羥甲基氨基甲烷IARL6IP5基因在原發(fā)性肝癌中的生物學(xué)作用中文摘要目的：

探討ARL6IP5在肝癌，特別是丙型肝炎相關(guān)性肝癌的形成過程中的生物學(xué)功能。

為肝癌的診斷與治療提供新思路和策略。

方法：

收集人肝癌組織8對（HCV陽性4對，HCV陰性4對）。

急性和慢性DEN處理（急性處理,一次性單劑量腹腔內(nèi)注射150mg/kgDEN,6天；慢性處理,一次性單劑量腹腔內(nèi)注射50mg/kgDEN,48周）小鼠，誘導(dǎo)肝損傷和肝癌動物模型。

獲得小鼠肝癌組織及小鼠非癌肝組織共54例，經(jīng)實時熒光定量PCR(qPCR)和westernblot方法檢測ARL6IP5的表達(dá)情況。

給Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染HCV核心蛋白JFH1,用qPCR和westernblot方法檢測被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中ARL6IP5的表達(dá)情況。

選用HCV相關(guān)肝癌細(xì)胞株Huh7和永生化肝細(xì)胞MIHA，用小分子RNA干擾技術(shù)（siRNA-ARL6IP5）沉默ARL6IP5基因，然后檢測該基因沉默后對細(xì)胞增殖能力、侵襲能力、克隆形成能力和細(xì)胞凋亡的影響。

同時檢測該基因沉默后對其他主要的信號通路如MAPKs(pERK1/2、pP38和pJNK)是否產(chǎn)生影響。

選用Huh7和MIHA細(xì)胞株構(gòu)建基因ARL6IP5過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株，以空載體表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株為對照，在這些細(xì)胞中進(jìn)行上述功能實驗。

結(jié)果：

人肝癌組織中ARL6IP5的平均表達(dá)水平明顯高于癌旁組，同時HCV陽性的肝癌組織中ARL6IP5的表達(dá)明顯高于HCV陰性組。

在給小鼠給予短期DEN處理后，小鼠肝組織中ARL6IP5的表達(dá)升高。

DEN慢性處理（即給予DEN后～48周左右）小鼠中，多數(shù)出現(xiàn)肝腫瘤。

利用westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)小鼠的腫瘤組織中ARL6IP5的表達(dá)明顯高于非癌肝組織。

在Huh7細(xì)胞感染HCV核心蛋白JFH1之后，ARL6IP5的表達(dá)也明顯增高。

細(xì)胞功能實驗顯示，ARL6IP5沉默后，Huh7與MIHA細(xì)胞的增殖、遷移、克隆形成能力及侵襲能力均明顯降低，細(xì)胞凋亡增加，尤其早期凋亡增加明顯，同時，MAPK信號通路中磷酸化ERK1/2(pERK1/2)與磷酸化p38(p-p38)表達(dá)均發(fā)生上調(diào)。

以上結(jié)果均顯示出顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

相比之下，在ARL6IP5穩(wěn)定過表達(dá)的Huh7與MIHA細(xì)胞，觀察到與上述相反的改變趨勢，即細(xì)胞的增殖、遷移、克隆形成能力及侵襲能力有所增加，而細(xì)胞凋亡減少，但實驗組與對照組結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié)論：

我們首次證實ARL6IP5可能是一種新的癌基因。

我們推斷，在正常生理狀況下，該基因就具有潛在的癌基因生物學(xué)特性，當(dāng)受到致癌因素刺激，如丙型II病毒性肝炎感染后，該癌基因有可能活化，通過促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移，侵襲，抑制凋亡等作用參與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。

目前的研究結(jié)果為未來進(jìn)一步在體內(nèi)實驗明確證實該基因是否為致瘤癌基因研究奠定了理論依據(jù)和基礎(chǔ)，也為人類肝癌特別是HCV相關(guān)肝癌診斷和治療提供新思路和治療靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：

ARL6IP5，肝癌，HCV，JFH1IIIBiologicalfunctionofARL6IP5inprimarylivercancerAbstractAim:ToexaminethebiologicalfunctionofARL6IP5inlivercancer,withaparticularemphasisonHCVinducedlivercancer.Methods:Eightpairsofhumanlivercancertissues(fourpairsareHCVpositive,andfourpairsareHCVnegative)werecollectedfromWestmeadHospital,TheUniversityofSydney,Australia.54Livertissuesfromdiethylnitrosamine(DEN)treatedC57mice(includingacutetreatment,DENsingledose150mg/kg,6days,andchronictreatment,DENsingledose50mg/kg,48weeks)wereobtainedfromtheStorrLiverUnitoftheWestmeadMillenniumInstitute,theUniversityofSydney,Australia.TheexpressionofARL6IP5inthesetissueswasexaminedbyreal-timequantitativePCR(qPCR)andwesternblot.TheexpressionofARL6IP5wasalsoexaminedbyqPCRandwesternblotinhumanlivercancercelllineHuh7cellsafterbeingtransfectedwithHCVcoreproteinJFH1.ThebiologicalfunctionofARL6IP5wasfurtherexaminedinHuh7cellsandanimmortalizedhumanhepatocytesMIHAinwhichARL6IP5wassilencedbysmallinterferingRNA(siRNA)againstARL6IP5(siRNA-ARL6IP5),orARL6IP5wasover-expressedviastabletransfection.TheimpactofARL6IP5modulationoncellproliferation,migration,colonyformation,invasion,andapoptosiswasexaminedbyBrdUcellproliferationassay,woundhealingassay,colonyformationassay,chamberinvasionassay,andFACScananalysis,respectively.Meanwhile,theimpactofARL6IP5ontheexpressionofotherimportantsignalingpathwaygenes,includingpERK1/2,pP38andpJNKwereexaminedbywesternblot.Results:HigherexpressionlevelofARL6IP5wasfoundinHCCtissuescomparedtonon-canceroushepatictissues.Furthermore,HCVpositiveHCCtissuesexpressedamuchhigherlevelofARL6IP5thaninHCVnegativeHCCtissues.TreatmentofC57micewithasingledoseofDENforsixdaysledtoatransientincreaseintheexpressionofARL6IP5intheliver.Approximately48weeksafterasingledoseofDENtreatment,themajorityofmicedevelopedlivercancers,andthehepaticexpressionofARL6IP5inthesecancertissueswasmuchhigherthaninnon-cancerouslivertissues.TransfectionofHuh7cellswithHCVcoreJFH1ledtoamarkedincreaseintheexpressionofARL6IP5,asexaminedbyqPCRandwesternIVblot.FunctionalstudiesshowedthatsilencingofARL6IP5bysiRNA-ARL6IP5ledtoadecreasedcellproliferation,migration,colonyformation,andinvasion,butincreasedapoptosis.Thesechangeswereassociatedwithanup-regulationofpERK1/2andpP38.Statisticallysignificantdifferenceswerefoundfromalltheaboveresults(P0.05).Incontrast,stablyover-expressingARL6IP5inHuh7andMIHAcellsledtoanincreasedcellproliferation,migration,andinvasion,butareducedapoptosis,althoughthesechangesdidnotreachstatisticsignificance.Conclusion:ThesefindingsstronglysupportanoncogenicroleofARL6IP5inlivercancerformation.Inparticular,ARL6IP5maybeanimportantmediatorforHCVinducedhepatocarcinogenesis.WespeculatethatinresponsetocertainstimulisuchasHCVinfection,thereisanactivationofARL6IP5signaling,whichmightfacilitatethemalignanttransformationoftheinjuredlivercellsviaincreasingtheirabilitytoproliferate,migrateandinvade.Thesefindingsnotonlyhelpusbetterunderstandthemechanismsoflivercancerformation,particularlyhowHCVinduceslivercancer,butalsosuggestthatARL6IP5maybeofpotentialvalueasatherapeutictarget.Morestudiesinlargenumberofclinicalsamplesandrobustanimalmodelsarewarranted.Keywords:ARL6IP5,livercancer,HCV,JFH1蘭州大學(xué)博士學(xué)位論文ARL6IP5基因在原發(fā)性肝癌中的生物學(xué)作用1目錄中文摘要IAbstractIII目錄1前言第一部分ARL6IP5在肝癌組織及Huh7JFH1細(xì)胞中的表達(dá)錯誤！未定義書簽。

錯誤！未定義書簽。

1.1實驗材料錯誤！未定義書簽。

1.1.1組織標(biāo)本、細(xì)胞株和主要試劑錯誤！未定義書簽。

1.1.2相關(guān)溶液的配制錯誤！未定義書簽。

1.1.3相關(guān)儀器設(shè)備錯誤！未定義書簽。

1.2實驗方法錯誤！未定義書簽。

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇錯誤！未定義書簽。

1.2.2組織標(biāo)本的收集錯誤！未定義書簽。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測錯誤！未定義書簽。

1.2.4WesternBlottingAssay（蛋白免疫印跡實驗）檢測錯誤！未定義書簽。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)分析與處理錯誤！未定義書簽。

1.3實驗結(jié)果錯誤！未定義書簽。

1.3.1實時熒光定量PCR檢測ARL6IP5在RNA水平的表達(dá)情況錯誤！未定義書簽。

1.3.2Westernblot檢測基因ARL6IP5在蛋白水平的表達(dá)情況錯誤！未定義書簽。

1.4結(jié)論及其意義錯誤！未定義書簽。

第二部分ARL6IP5在人肝癌細(xì)胞株Huh7中的生物學(xué)功能錯誤！未定義書簽。

2.1實驗材料錯誤！未定義書簽。

2.1.1組織標(biāo)本，細(xì)胞株和主要試劑錯誤！未定義書簽。

2.1.2相關(guān)溶液的配制錯誤！未定義書簽。

2.1.3相關(guān)儀器設(shè)備錯誤！未定義書簽。

2.2實驗方法錯誤！未定義書簽。

蘭州大學(xué)博士學(xué)位論文ARL6IP5基因在原發(fā)性肝癌中的生物學(xué)作用22.2.1細(xì)胞增殖實驗（BrdU）錯誤！未定義書簽。

2.2.2細(xì)胞劃痕愈合實驗錯誤！未定義書簽。

2.2.3平板細(xì)胞克隆形成實驗錯誤！未定義書簽。

2.2.4腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移實驗錯誤！未定義書簽。

2.2.5流式細(xì)胞分選實驗錯誤！未定義書簽。

2.2.6小分子RNA干擾技術(shù)（siRNA）錯誤！未定義書簽。

2.2.7質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增、抽提與轉(zhuǎn)染錯誤！未定義書簽。

2.2.8實時熒光定量PCR與WesternBlottingAssay檢測錯誤！未定義書簽。

2.2.9細(xì)胞的培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇錯誤！未定義書簽。

2.2.10統(tǒng)計學(xué)分析與處理錯誤！未定義書簽。

2.3實驗結(jié)果錯誤！未定義書簽。

2.3.1穩(wěn)定細(xì)胞株的鑒定結(jié)果錯誤！未定義書簽。

2.3.2siRNA-ARL6IP5基因沉默的鑒定結(jié)果錯誤！未定義書簽。

2.3.3細(xì)胞增殖實驗（BrdU）錯誤！未定義書簽。

2.3.4細(xì)胞劃痕愈合實驗錯誤！未定義書簽。

2.3.5細(xì)胞克隆形成實驗錯誤！未定義書簽。

2.3.6腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移實驗錯誤！未定義書簽。

2.3.7流式細(xì)胞分選實驗錯誤！未定義書簽。

2.3.8Westernblot檢測錯誤！未定義書簽。

2.4結(jié)論及其意義錯誤！