NFκB及其相關(guān)炎性因子致大鼠移植肝冷保存損傷的機(jī)制-0

1/1NFκB及其相關(guān)炎性因子致大鼠移植肝冷保存損傷的機(jī)制NFB及其相關(guān)炎性因子致大鼠移植肝冷保存損傷的機(jī)制作者：

蔣安，劉峰，劉昌，宋宇龍，孟珂?zhèn)?，呂毅蔣安【摘要】目的通過大鼠移植肝在不同冷保存時(shí)間再灌注后核因子B(nucleartranscriptionfactorB,NFB)及其相關(guān)炎性因子的激活情況，判斷冷保存時(shí)間、NFB激活以及移植肝功能損傷三者之間的聯(lián)系。

方法用Wistar大鼠建立原位肝移植模型，假手術(shù)組(A組)作為對(duì)照組，觀察大鼠移植肝在4℃UW液中保存45min(B組)、120min(C組)、180min(D組)以及再灌注3h后肝組織、血清中NFB、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素1(IL1)和肝損傷指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和肝細(xì)胞凋亡的變化情況。

結(jié)果隨著移植肝冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)NFB逐漸激活(Plt;0.05)，并使肝組織內(nèi)TNF、IL1水平上調(diào)(Plt;0.05)；再灌注后，NFB近一步激活(Plt;0.05)，肝組織中TNF、IL1進(jìn)一步上調(diào)(Plt;0.05)，ALT、AST和肝細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高(Plt;0.05)，肝功能損害加重。

結(jié)論NFB在供肝的冷保存階段隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈誘導(dǎo)性激活，再灌注后呈爆發(fā)式激活，并通過上調(diào)其靶基因TNF、IL1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生肝臟損傷，這可能是肝臟冷保存再灌注損傷發(fā)生的重要機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】肝移植；器官保存；冷保存再灌注損傷；核因子BABSTRACT:ObjectiveToestablishamodelofratorthotopiclivertransplantationandinvestigatetherelationshipamongcoldpreservationtime,activationofnucleartranscriptionfactorB(NFB)anddonorpreservationinjuryafterlivertransplantation.MethodsOrthotopiclivertransplantationwasperformedinWistarratswhichwererandomlydividedintothefollowinggroupsaccordingtothedifferentdurationoflivercoldstorageinUWsolution:groupA(shamoperation,n=10),groupB(45mincoldstoragegroup,n=10),groupC(120mincoldstoragegroup,n=10),andgroupD(180mincoldstoragegroup,n=10).TheexpressionofNFBinliverbeforeandaftertransplantationwasmeasuredbyelectrophoreticmobilityshiftassays;proteinexpressionoftumornecrosisfactoralpha(TNF)andinterleukin1beta(IL1)intheliverwasmeasuredbyimmunohistochemistry;theserumTNFandIL1,alanineaminotransferase(ALT),aspartateaminotransferase(AST)andhepaticcellapoptosiswereexamined.ResultsWithextendedcoldstorageduration,theactivityofNFBinthedonorliverincreased(Plt;0.05,groupDvs.groupsA,BandC).TNFandIL1levelsalsoincreased(Plt;0.05,groupDvs.groupsA,BandC).Donorliverreperfusioninjurywasgraduallyaggravatedwiththeprolongingofgraftcoldpreservation.BoththeserumTNFandIL1levelsincreasedhighly(Plt;0.05groupAvs.groupsB,CandD),andtheexpressionofNFBintheliversignificantlyincreased(Plt;0.05,groupAvs.groupsD,BandC)withgradualprolongingofgraftcoldpreservationtime.TheserumALTandASTlevelandapoptosisindexlevelelevatedgreatly(Plt;0.05,groupAvs.groupsD,BandC).ConclusionNFBofdonorliverwasactivatedinductivelyincoldpreservationphaseandactivatedexplosivelyinreperfusionphase.Thelongercoldpreservationtimewas,thehigherNFBlevelindonorliverbecame.NFBledtotheexpressionofTNFandIL1indonorliver.Inflammatoryfactorsareoneofthemostimportantmechanismsforthedonorliverinjuryafterlivertransplantation.KEYWORDS:livertransplantation;organpreservation;coldpreservationwarmreperfusioninjury;nucleartranscriptionfactorB移植肝冷保存再灌注損傷(coldpreservationwarmreperfusioninjury,P/RI)是移植肝功能不良(poorgraftfunction,PGF)和原發(fā)性無功能(primarynonfunction,PNF)的直接原因[1]。

PGF及其嚴(yán)重形式PNF的發(fā)生率分別占移植總數(shù)的5%～10%[2]和1.4%～8.5%[3]。

PNF占術(shù)后1周內(nèi)再次肝移植病因的81%和再次肝移植總病因的21.7%[1]，危害嚴(yán)重。

冷保存時(shí)間超過20h，PNF發(fā)生率是保存4h以內(nèi)的4倍[4]，所以冷保存時(shí)間是PNF的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[5]。

而且，P/RI還可導(dǎo)致多器官功能不全和膽管非吻合口狹窄等并發(fā)癥[6]，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。

因此，如何最大限度地減輕供肝冷保存損傷、提高移植物成活率是當(dāng)今肝移植領(lǐng)域面臨的重要課題。

本實(shí)驗(yàn)通過研究移植肝P/RI過程中核轉(zhuǎn)錄因子B(nucleartranscriptionfactorB,NFB)及其相關(guān)炎性因子的表達(dá)變化，探討NFB在移植肝冷保存中的作用機(jī)制。

1材料與方法1.1動(dòng)物模型的制作清潔級(jí)健康成年封閉群雄性Wistar大鼠70只(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重(27231)g。

術(shù)前禁食12h，不禁飲，清潔手術(shù)。

氯胺酮100mg/kg體重腹腔注射麻醉。

采用改良兩袖套法建立大鼠全血供原位肝移植模型[7]。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組依據(jù)供肝冷保存時(shí)間的不同，將Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：

A組，假手術(shù)組；B組，冷保存45min再灌注3h組；C組，冷保存120min再灌注3h組；D組，冷保存180min再灌注3h組。

供肝以4℃UW液保存，冷保存結(jié)束前，留取乳頭葉腹側(cè)葉片。

移植肝植入3h后，留取乳頭葉背側(cè)葉片，并取血留作標(biāo)本。

1.3觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法1.3.1肝組織NFB水平的測(cè)定凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoreticmobilityshiftassays,EMSA)按YANG等[8]的方法提取肝組織的核蛋白，-70℃凍存?zhèn)溆茫每捡R斯亮藍(lán)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)測(cè)定蛋白濃度。

結(jié)合NFB的寡核苷酸探針(上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)雙鏈核苷酸序列為5AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3，3TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5，以32PATP(北京福瑞生物工程公司產(chǎn)品)進(jìn)行探針標(biāo)記。

室溫下將2L5凝膠滯留結(jié)合緩沖液、核蛋白10g、鮭精DNA(4g/L)1L混勻，10min后加入32PATP標(biāo)記的NFB探針2L，反應(yīng)30min后加入5上樣緩沖液2L，60g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳2h(110V)后，-70℃放射自顯影6h。

X光片置于BIORAD凝膠圖象分析系統(tǒng)測(cè)定NFB活性值(A值)來表示提取物中NFB的DNA結(jié)合活性。

NFB活性值(A)=滯后帶吸光度值(A)滯后帶面積值(S)。

1.3.2冷保存期肝組織TNF和IL1的測(cè)定采用免疫組化SABC法在石蠟切片上測(cè)定TNF和IL1的表達(dá)。

TNF和IL1主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表現(xiàn)為胞質(zhì)黃染或棕黃色顆粒。

免疫組化染色結(jié)果判定參照MATTERN的方法[9]。

陽(yáng)性染色深度：

未見染色為0，輕度染色(染成淺黃色)為1，中度染色(染成棕黃色)為2，深度染色(染成棕褐色)為3；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：

未見染色為0，染色細(xì)胞lt;25%為1，25%～50%為2，gt;50%為3。

將這兩方面得分相加，得分0～2分判為陰性表達(dá)，gt;2分(3～6)判為陽(yáng)性表達(dá)。

每組10例標(biāo)本，每例標(biāo)本隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，記數(shù)100個(gè)細(xì)胞判定此例標(biāo)本的表達(dá)為陽(yáng)性或陰性，并計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3.3TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡肝組織石蠟切片厚4m，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)。

按DeadEndTMTUNEL檢測(cè)試劑盒(Promage,USA)操作說明進(jìn)行操作。

陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色著色。

每張切片光鏡(2015)觀察10500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，即凋亡指數(shù)(apoptosisindex,AI)。

1.3.4再灌注后血清TNF、IL1的測(cè)定血清TNF、IL1采用雙抗體夾心ELISA法，試劑盒購(gòu)自晶美生物工程公司，采用德國(guó)FLUOstarOPTIMA高通量微板測(cè)試系統(tǒng)測(cè)定。

1.3.5再灌注后血清ALT、AST的檢測(cè)采用日立生化分析儀7160，進(jìn)行血清ALT、AST的檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。

各組樣本間均數(shù)用單因素方差分析比較，各組間陽(yáng)性率用四格表的確切概率法比較。

Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果2.1大鼠肝移植模型的制備情況正式實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行大鼠肝移植手術(shù)30例，手術(shù)死亡3例，成功率90%。

供體手術(shù)(18.65.2)min，供肝修整(8.53)min；受體手術(shù)(30.26.4)min，無肝期(15.53.3)min。

門靜脈開放后，肝臟顏色迅速變紅，并可以看到少量金黃色膽汁分泌。

3h時(shí)存活受體大鼠可自行活動(dòng)、飲水，滿足獲取標(biāo)本需要。

2.2肝組織冷缺血期和再灌注期NFB的測(cè)定結(jié)果NFB在B組和C組冷保存期均呈現(xiàn)不同程度活化，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。

D組同其他冷保存組相比，NFB活性顯著增高(Plt;0.05)。

再灌注后，B組、C組和D組NFB活性均較假手術(shù)組活性水平增高(Plt;0.05)。

隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)，NFB活性增高(Plt;0.05，表1、圖1)。

表1不同冷保存時(shí)間組移植肝NFB的活性（略）2.3冷保存期肝組織TNF、IL1的測(cè)定結(jié)果隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)，TNF和IL1在肝組織中的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，D組TNF和IL1的陽(yáng)性表達(dá)率較A、B、C組明顯升高(Plt;0.05，表2)。

表2不同冷保存時(shí)間肝組織TNF及IL1的表達(dá)（略）2.4再灌注期血清TNF、IL1及ALT、AST的測(cè)定結(jié)果再灌注后，B、C、D組TNF和IL1均較假手術(shù)組明顯升高(Plt;0.05)，而且隨著冷保存時(shí)間延長(zhǎng)，兩種細(xì)胞因子活性均升高(Plt;0.05)。

隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)，再灌注后血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05，表3)。

表3再灌注后血清TNF、IL1、ALT、AST水平和細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的變化（略）2.5再灌注后肝細(xì)胞的凋亡情況凋亡細(xì)胞在TUNEL染色中顯示為棕色或褐色小點(diǎn)。

A組為正常肝組織，凋亡細(xì)胞罕見；隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)，移植肝再灌注后凋亡細(xì)胞在B、C、D組中表達(dá)逐漸增多，在中央靜脈周圍分布較多。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)后得出：

隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)AI值逐漸升高，B、C、D組AI值均較A組明顯升高(Plt;0.05)，而且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05，表3、圖2)。

3討論NFB是一類能與多種基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子B位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。

胞質(zhì)中的NFB/IB三聚體，可被TNF、IL1、活性氧等多種細(xì)胞外刺激信號(hào)激活，繼而NFB活化入核，與靶基因特異性序列結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括黏附分子、趨化因子和細(xì)胞因子(TNF、IL1)等，這些炎性介質(zhì)參與P/RI的病理過程[10]。

在本實(shí)驗(yàn)中可見，隨著供肝冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)，供肝中NFB水平顯著增高。

其機(jī)制可能是隨冷保存時(shí)間延長(zhǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多，低氧及氧化應(yīng)激介導(dǎo)NFB激活，調(diào)控TNF、IL1表達(dá)增高[11]。

再灌注后各組肝組織中NFB以及血清TNF、IL1水平均較冷保存期明顯增高，并隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)活性增強(qiáng)。

TUNEL顯示肝細(xì)胞凋亡加重，反映肝損傷的酶學(xué)指標(biāo)(ALT、AST)亦明顯升高，表明再灌注后NFB產(chǎn)生爆發(fā)式激活，轉(zhuǎn)錄大量TNF、IL1，進(jìn)一步加重供肝的損傷。

其機(jī)制可能與移植肝再灌注后呼吸爆發(fā)、氧化應(yīng)激大大增強(qiáng)有關(guān)，而其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如TNF、IL1又可進(jìn)一步激活NFB，形成正反饋。

可見，供肝的冷保存和再灌注是兩個(gè)既獨(dú)立又關(guān)聯(lián)的過程。

供肝的NFB在冷保存期間就已經(jīng)受到預(yù)激，并表達(dá)多種炎癥介質(zhì)，成為再灌注損傷的始動(dòng)因子；在再灌注階段NFB的效應(yīng)迅速放大，進(jìn)一步激發(fā)并維持炎癥反應(yīng)，損傷供肝[12]。

其中TNF在肝損傷中發(fā)揮重要作用，可以直接或誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死、凋亡[13]；而IL1誘導(dǎo)Kuppfer細(xì)胞產(chǎn)生TNF，上調(diào)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生更多的自由基。

二者的協(xié)同作用引起血管擴(kuò)張和白細(xì)胞介導(dǎo)的組織壞死，最終導(dǎo)致器官衰竭。

NFB與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切,其參與多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,具有抑制細(xì)胞凋亡作用及促細(xì)胞凋亡的雙向作用，可能與不同亞基的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，可以不通過炎性因子的作用，直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。

在本實(shí)驗(yàn)中NFB顯示出促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡的作用。

總之，隨著移植肝冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)，肝內(nèi)NFB存在不同程度的預(yù)激，再灌注后大量活化的NFB通過上調(diào)TNF、IL1的表達(dá)直接或間接導(dǎo)致移植肝的損傷。

這可能是移植肝再灌注損傷的重要機(jī)制，而抑制NFB可能是一條減輕移植肝再灌注損傷的有效方法。

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