I型內(nèi)皮素受體反義寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及內(nèi)膜增生

1/1I型內(nèi)皮素受體反義寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及內(nèi)膜增生I型內(nèi)皮素受體反義寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及內(nèi)膜增生I型內(nèi)皮素受體反義寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及內(nèi)膜增生作者：

錢濟(jì)先，張柏根，李桂云，張嵐，鄧廉夫，朱雅萍【關(guān)鍵詞】?jī)?nèi)皮素關(guān)鍵詞:內(nèi)皮素;反義寡核苷酸;血管平滑肌細(xì)胞摘要:目的觀察Ⅰ型內(nèi)皮素受體反義寡核苷酸對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增生的抑制作用.方法①細(xì)胞培養(yǎng):取家兔主動(dòng)脈中膜消化后培養(yǎng)傳代，經(jīng)抗-actin鑒定后使用第4～6代傳代細(xì)胞;②人工合成ODN:經(jīng)Genbank檢索篩選，合成含18bpETA-ODN片段，再對(duì)5’端硫代修飾以增加穩(wěn)定性，同時(shí)行嶠地高辛標(biāo)記以檢測(cè)反義片段的細(xì)胞膜穿透性;③MTT分光光度法檢測(cè)ETA-O刑DN對(duì)VSMC增殖的抑制作用;④運(yùn)用丌放射受體結(jié)合分析法了解ODN對(duì)ETA緄蛋白表達(dá)的抑制作用，以探討其反義作用堅(jiān);⑤兔頸動(dòng)脈空氣干燥模型在體研究OD栲N對(duì)血管內(nèi)膜增生的抑制作用:應(yīng)用F-雍127凝膠載體攜帶ETA-ODN導(dǎo)入血管周圍，術(shù)后不同時(shí)間觀察增生內(nèi)膜相醢對(duì)厚度.結(jié)果ODN于培養(yǎng)后12h進(jìn)盜入細(xì)胞內(nèi)，并逐漸增加;15molL-1ETA-ODN對(duì)VSMC增殖具有淶抑制作用，24h后即有顯著作用;ET驀A-ODN對(duì)ETA表達(dá)亦有明顯的抑制霎作用，表現(xiàn)為CPM于24h逐漸減少;汐ETA-ODN導(dǎo)入后，血管增生內(nèi)膜相颼對(duì)厚度減少.結(jié)論ETA-ODN以濃度和時(shí)間依賴方式抑制ETA蛋白表達(dá)以鵪及VSMC的增殖;反義寡核苷酸是通過裔反義機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)ETA蛋白和VSMC增殖的抑制作用.Antisens饑eendothelin┐1recep洛toroligonucleotide濮in┐hibitvascularsm鶚oothmusclecellprol隙iferationandintima薰lhyperplasiaAbs穎tract:AIMToevaluat栩etheinhibitiveeffe╀ctofantisenseendot佑helin-1receptoroli惴gonucleotideonVSMCぷgrowthandintimal①Cellcul-ture.Themed┮iumofrabbitaortawereharvested，digest迄edandthedispersionswerecellsofpassag池e4～6wereroutinelyusedtostudyafteride嶠ntificationwith-actinantibody.②ODNa豢ntisensesequencesweredesignedandscreenedthroughGeneban冒ktheseprocedures，E悍ighteenphosphoroth猝ioateantisensecom-夙plementarytoETAcDN泅Aweresynthesized，a棲ndeventuallylabele尾dwithdigoxinbywhic戲hthesequencesstabi嚅litybeaug-mentedan藍(lán)dmembranouspermeabilitytested.③MTTme青thodwasusedtoevaluateDNAsynthesisinO＃DNtreatedVSMC.④125敬I-ET-1radiobinding臃assaytoETAandimmun挾o-histochemistrywe遭reutilizedtoexamin展eprotEInexpression┃ofthereceptor，andt衷odiscussrolesoftheODN.⑤ODNdis-solved巰in200mLL-1F-127gel賑solutionatconcentr黲ationmolL-1wereap致pliedtosurroundthe侉exposedregionofcar湯otidarteryonthebasisofAirDrytheinti-淝malthicknessandlum板inalnarrownesscouldbe①ETA-ODNcouldbe鰣foundinculturedVSM致Cin12handgradually兆increased.②ETA-ODN筘atconcentra-tionof劇15molL-1suppresse劃dVSMCproliferation繹，whichshowedasigni吁ficantactionin24h.嗒③ETAproteinexpres-sionwasreduced，ind宓icatedbythephenome鑌nasthatCPMprogress窨ivelydecreasedin24ｂh.④Intimalthicknes倔sandlu-minalnarrow皇nesswerelightenedaＴfterETA-ODNETA-ODN減suppressesETAexpre嗥ssionandSMCprolife婊rationinatimeandco彩ncentrationdependentplaysanimportant蕢roleinmediatingcul桿turedVSMCprolifera呸tionexertsinhibito四ryfunctionthrougha磴ntisensemechanism.綿0引言血管移植或動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)后儷血管內(nèi)膜均不同程度地發(fā)生增生，嚴(yán)重的櫸可致血管狹窄或再狹窄.內(nèi)膜增生的細(xì)胞簡(jiǎn)學(xué)基礎(chǔ)是血管中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移瀆并增殖，因此若能控制血管SMC增殖即峁可實(shí)現(xiàn)抑制內(nèi)膜增生.既往人們用化學(xué)藥餾物，如阿斯匹林、潘生汀、肝素和類皮質(zhì)檬激素等試圖抑制血管內(nèi)膜增生［1］，但狙效果均不理想.近年來的研究證明I型內(nèi)檉皮素在誘導(dǎo)血管收縮和VSMC增殖方面蟠起重要作用，在動(dòng)脈粥樣硬化的VSMC茫中，Ⅰ型內(nèi)皮素受體mRNA表達(dá)顯著增凌多［2］，而且ET-1可增加VSMC蠖內(nèi)3H-TdR結(jié)合率［3］，增強(qiáng)PDGF誘導(dǎo)的DNA合成［4］.現(xiàn)已明確愛，ET在血管內(nèi)膜增生中發(fā)揮著重要的促賒分裂效應(yīng).作為基因治療的一方面，反義拂技術(shù)已逐漸成為血管領(lǐng)域的重要的治療方疙法［5］.針對(duì)ET-1及其受體ETA敬在血管SMC增殖和內(nèi)膜增生中的重要作陰用，我們合成了含18bp的ETA反義送寡聚核苷酸，并經(jīng)硫代膦酸修飾，在離體黽SMC培養(yǎng)和動(dòng)物在體模型基礎(chǔ)上探討O粢DNS對(duì)VSMC上ETA蛋白表達(dá)、S旌MC增殖和內(nèi)膜增生的影響，為防治血管幄內(nèi)膜增生和血管狹窄提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).腐1材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)無菌尋取家兔主動(dòng)脈段，去內(nèi)外膜置100mLL-1NBSDMEM培養(yǎng)液中，剪碎，洎吸去DMEM，加L-1胰蛋白酶震覯蕩消化45min，低速離心，棄組織塊噍，收集上清液加培養(yǎng)液移至培養(yǎng)瓶，置3輳7℃，50mLL-1CO2孵箱.取用芻第4～6代細(xì)胞，多余細(xì)胞分裝凍存?zhèn)溆藐?SMC鑒定將SMC按每孔1疴104個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)種于置有無菌載玻片的6孔板內(nèi)，37℃，50mLL-1CO2燒孵箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至一定密度時(shí)蚤取出載玻片，免疫組化染色后觀察.反義核苷酸的設(shè)計(jì)合成根據(jù)已克隆的大鼠ETA核酸序列［6］，經(jīng)中科院上舒海生化所Genebank檢索后，分別篩選并設(shè)計(jì)特異性高的含18bp的反義嗓片段，DNA合成儀合成30A的寡核苷酸.同法合成相應(yīng)的正義片段.另外合成逸標(biāo)有地高辛的反義ETA10A，以驗(yàn)證茯反義核酸的膜穿透性.5’端堿基硫代磷酸化修飾以增加寡核苷酸在血清中的穩(wěn)定咻性.ODN的膜透性檢測(cè)將地簽高辛修飾標(biāo)記的ETAODN與SMC共甕培養(yǎng)，爬片生長(zhǎng)，孵箱培養(yǎng)4，12，2拍4和48h后取出玻片，通過抗體免疫組喚化呈色反應(yīng)以顯示ODN的細(xì)胞膜透性.曉每種因素重復(fù)3次.ETA┐OD燒N對(duì)血管SMC增殖的作用MTT實(shí)驗(yàn)縻取第四代細(xì)胞接種96孔板，密度每孔貔1104細(xì)胞，孵育48h，分別加入詰，和molL-1，設(shè)立正義對(duì)照、陰┿性對(duì)照和空白對(duì)照，每組3孔，培養(yǎng)12锝，24，48和72h后分別加入質(zhì)量分沿?cái)?shù)為50mgL-1的MTT，孵育4h周后再加入二甲基亞砜20L，移至酶標(biāo)遭儀測(cè)定光度值.細(xì)胞生長(zhǎng)計(jì)數(shù)根據(jù)上述諶結(jié)果，用15molL-1濃度的ET模A-ODN觀察對(duì)SMC生長(zhǎng)的抑制作用.按1104密度接種24孔板，時(shí)間闔組和其他步驟同上，在倒置顯微鏡下計(jì)算蜍活細(xì)胞個(gè)數(shù).ETA┐ODN對(duì)ETA蛋白表達(dá)作用放射受體結(jié)合分析法將經(jīng)ETA-ODN處理過的細(xì)胞制成懸浮液，加入125I-ET-1250逯L，37℃孵育2h，離心棄上清，用疽冷DMEM快速洗3遍，進(jìn)行計(jì)數(shù).以椿加入10-7molL-1未標(biāo)記的ET赴-1200L后所得的每分計(jì)數(shù)作為非粗特異性結(jié)合率，樣品的cpm減去非特異邈性結(jié)合的cpm為125I-ET-1的绔特異性結(jié)合率.ETA┐ODN對(duì)哐血管內(nèi)膜增生的作用的在體實(shí)驗(yàn)血管模幫型的建立和反義寡核苷酸的導(dǎo)入30菱mLL-1戊巴比妥鈉靜脈麻醉，家兔取ロ仰臥位消毒后，沿頸正中切開皮膚，顯露祭頸動(dòng)脈，輕柔剝離外膜后游離頸動(dòng)脈長(zhǎng)，捶上下無創(chuàng)夾阻血后，從一端注入空氣，另鯁一端抽出空氣，持續(xù)10min，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落.在血管周圍注入4℃預(yù)冷、混有ETA-ODN的200mLL拷-1F-127多聚凝膠500L，寡加核苷酸的濃度為molL-1.F-1椿27在37℃時(shí)呈固態(tài)凝膠，待其由液態(tài)奢變?yōu)楣虘B(tài)后縫合皮膚.動(dòng)物分組健讓康成年家兔24只，體質(zhì)量kg，雌雄不怎拘，隨機(jī)分為3組，每組2只.一組為O丶DN處理組，其他兩組為陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，術(shù)后48h，1，2和4wk塄不同時(shí)間取材.取材時(shí)注意使血管不扭曲Ё，保持合適張力.微機(jī)圖像分析標(biāo)本切片圖像經(jīng)顯微攝像機(jī)攝入圖像分析甌系統(tǒng)后，計(jì)算血管增生內(nèi)膜的厚度.其中窗內(nèi)膜厚度以增生內(nèi)膜厚度與中膜和內(nèi)膜聯(lián)黼合厚度的相對(duì)值表示，每組圍繞管腔測(cè)1際0次，取平均值計(jì)算.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:組彝間采用團(tuán)體t檢驗(yàn).2結(jié)果細(xì)胞﹃培養(yǎng)及鑒定VSMC經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，抗-actin抗體免疫習(xí)組化陽(yáng)性，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為VSMC.ODN純度及膜透性檢測(cè)通過笈抗體免疫組化呈色反應(yīng)結(jié)果:4h陰性，扔12h弱陽(yáng)性，24和48h陽(yáng)性.說明庠ETAODN能在12h進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并脹在24和48h逐漸增多.ETR┐O磺DN對(duì)血管SMC增殖的作用MTT盧光度值結(jié)果如Tab1.從表中所知，1逄5molL-1的ETA-ODN24癇h與陰性對(duì)照組有顯著性差異，48h與喋陰性對(duì)照組也有顯著性差異;以培養(yǎng)后時(shí)哄間組比較，15molL-1ETA-縋ODN12與48h差異顯著，12與7橘2h也有顯著性差異，說明15mol綃L-1ETA-ODN對(duì)SMC增殖具有霜明顯的抑制作用.正義對(duì)照組與陰性對(duì)照ぇ組相近，說明正義寡核苷酸無效.表1加緦入ETA-ODN后VSMC的光吸度值細(xì)胞生長(zhǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果上述結(jié)果可見鄆15molL-1ETA-ODN具有倍明顯抑制SMC增殖的作用，因此用上述洪濃度的ETA-ODN觀察對(duì)SMC生長(zhǎng)籩的抑制作用，表明有明顯抑制VSMC生嗣長(zhǎng)的作用.表2加入ETA-ODN后V閼SMC生長(zhǎng)密度ODN對(duì)ETA蛋白表童達(dá)的抑制作用通過125I-ET-埠1放射受體結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)，經(jīng)Gamma⒁計(jì)數(shù)顯示15molL-1的ETA-蟬ODN具有明顯抑制ETA的表達(dá).隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ETA-ODN處理后c薪pm逐漸減少，到48h即有顯著性差異甬;與對(duì)照組相比，24h即有顯著性差異，說明ETA-ODN明顯抑制ETA表貌達(dá).表3加入ETA-ODN后VSMCETA┐ODN對(duì)血管內(nèi)膜增生的抑擊制作用經(jīng)反義基因?qū)牒?，結(jié)果顯示鱸ETA-ODN不僅減緩內(nèi)膜增生的發(fā)展，而且對(duì)內(nèi)膜增生具有明顯的抑制作用.表4血管內(nèi)膜相對(duì)厚度3討論VSMC增殖和內(nèi)膜增生是血管移植術(shù)、血空管成形術(shù)后狹窄或再狹窄的主要原因［7眢］.當(dāng)VSMC受外界因素刺激后，細(xì)胞萏內(nèi)部通過一系列信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)作用，啟動(dòng)鰉細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的基因表達(dá)，最終導(dǎo)丞致細(xì)胞增殖.其中，血管活性因子在促進(jìn)硫細(xì)胞增殖過程中起著重要作用.ET-1堀作為VSMC分裂增殖的強(qiáng)效生物活性物質(zhì)在誘導(dǎo)狹窄和再狹窄發(fā)生機(jī)制中占有重要地位［8］.過去研究已經(jīng)證明，VS董MC上ETA的表達(dá)與內(nèi)膜增生存在正相愍關(guān)效應(yīng)［9］，ET-1藉與ETA結(jié)合咀后觸發(fā)的促分裂可能在內(nèi)膜增生過程中發(fā)晨揮重要作用［10］.以前人們?cè)噲D應(yīng)用化學(xué)藥物抑制VSMC增殖和內(nèi)膜增生，坊但效果不理想，而且作用不特異.體外合咐成的反義寡核苷酸可特異與某些基因的D俞NA或mRNA結(jié)合，以阻止該基因的轉(zhuǎn)∵錄或翻譯，達(dá)到削弱該基因的目的.本研打究就是應(yīng)用ETA反義寡核苷酸特異抑制鳊ETA蛋白的表達(dá)，從而減弱ET-1促捷增殖效應(yīng).ET-1能顯著增加細(xì)胞內(nèi)3蝙H-TdR結(jié)合率，增強(qiáng)PDGF誘導(dǎo)的珧DNA合成，有人用3H-TdR結(jié)合率椹來反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)［11］.四唑藍(lán)氵比色試驗(yàn)法是檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的方法漪，它與細(xì)胞計(jì)數(shù)、軟瓊脂克隆試驗(yàn)和3H-TdR摻入試驗(yàn)有良好的相關(guān)性，而且，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、洶快速、易自動(dòng)化，因此本實(shí)驗(yàn)采用MTT撻法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況.本研究經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索并結(jié)合文獻(xiàn)［12］報(bào)道，發(fā)現(xiàn)15折molL-1濃度的ETA對(duì)培養(yǎng)的血管獷SMC具有抑制作用，并通過膜透性檢測(cè)鯁證實(shí)ETA-ODN能于培養(yǎng)后24h進(jìn)峒入細(xì)胞內(nèi)且發(fā)揮作用，說明ETA-OD疝N以濃度和時(shí)間依賴方式抑制SMC增殖，細(xì)胞生長(zhǎng)計(jì)數(shù)也顯示有良好的相關(guān)性.鮭實(shí)驗(yàn)還同時(shí)說明在本實(shí)驗(yàn)條件下ETA參與了VSMC的增殖過程，這與國(guó)外一些伸作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相佐［13］.對(duì)細(xì)胞內(nèi)刀相關(guān)基因蛋白水平的檢測(cè)，能了解該基因宏在細(xì)胞功能活動(dòng)中的活躍程度.由于目前痃無市售ETA抗體，本實(shí)驗(yàn)采用放射受體鄭結(jié)合分析法間接了解ETA蛋白表達(dá)情況廁，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ETA-ODN作用24h后即有明顯的抑制ETA表達(dá)的作用，說明喑ETA-ODN是通過反義途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)E箕TA的抑制.在體空氣干燥模型與球囊導(dǎo)管模型有同樣效率［14］，均可造成血鎖管內(nèi)皮細(xì)胞的脫落，繼而誘發(fā)內(nèi)膜增生.罟但空氣干燥模型操作簡(jiǎn)便快捷，損傷均勻，效果確切.F-127是一種具有特定桴物理性質(zhì)的多聚凝膠，在4℃時(shí)表現(xiàn)為液靡態(tài)，37℃時(shí)聚合成凝膠狀，利用這一特甘性，將一定濃度的寡核苷酸混合其中，轉(zhuǎn)拶到動(dòng)物體內(nèi)后，由于溫度上升，可迅速變ｉ為固態(tài)，使寡核苷酸較長(zhǎng)期而緩慢地釋放赳在血管周圍，避免了短時(shí)間內(nèi)大量寡核苷渙酸進(jìn)入體內(nèi)的副作用［15］.本結(jié)果顯豹示ETA-ODN能減少增生內(nèi)膜的厚度礓和管腔的狹窄，說明在體情況下ETA-ODN同樣具有抑制SMC增殖的作用.應(yīng)用F-127可達(dá)到局部定點(diǎn)高濃度緩涓釋寡核苷酸的作用，有效地提高了局部效漸應(yīng)，但對(duì)載體的穩(wěn)定性和反義寡核苷酸的媽毒性還需作進(jìn)一步研究.綜上所述，E榆TA-ODN以濃度和時(shí)間依賴性方式抑告制ETA蛋白表達(dá)以及VSMC的增殖;魏反義寡核苷酸是通過反義機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)ET筏A蛋白和VSMC增殖的抑制作用;在抑擁制血管內(nèi)膜增生和VSMC增殖方面ET凜A-ODN顯示出良好的臨床應(yīng)用前景.事參考文獻(xiàn):［1］BorlandJA，ChesterAH，Crab帙beS，ParkersonJB，Ca稍travasJD，YacoubactionofangiotensinIIＶandactivi-tyofangi紋otensin-converting┎enzymeinhumanbypas①sgrafts［J］.JThorac┹CardiovascSurg，199蟾8;116:206-212.［2］ｚKikkawaK，SaitoA，Iw翊asakiH，BanY，Yasosh７imaA，Ya-mauchiKR，H霪oshinoT，Murataofce渥rebralva-sospasmbyㄧanovelendothelinre又ceptorantagonist，T鴦A-0201［J］.JCardiov⒒ascPharmacol，1999;34:666-673.［3］YanagisawaH，HammerRE，貧RichardsonJA，Willi雉amsSC，ClouthierDE，杞Y(jié)anagisawaofendoth唧elin-1/endothelin-嗪Areceptor-mediated脧signalingpathwayin杭theaorticarchpat-terninginmice［J］.JC鷹linInvest，1998;102:22-33.［4］MoritaT潼，Kourembanascellex枰pressionofvaso-con料strictorsandgrowth販factorsisregulated溴bysmoothmusclecell蛸-derivedcarbonmono奇xide［J］.JClinInves俟t，1995;96:2676-268寶2.［5］BennettMR，Schwartztherapyforanゃgioplastyrestenosi珙s，somecriticalcons專iderations［J］.Circ疽ulation，1995;92:19呈81-1993.［6］LinHY，侍KajiEH，Winkelandfu膜nctionalexpres-sio蓉nofavascularsmooth膏muscleendothelin1r留eceptor［J］.ProcNatlAcadSci，1991;88:3覬185-3189.［7］Masoo苔dI，PorterK，Londonaяmediatorofintimalh腸yperplasiainorganc餑ultureofhumansaphe吸nousvEin［J］.BrJSur珙g，1997;84:499-503.表［8］LiGY，XinXY，Qia晁nJX，Zhuroleofen-do徠thelin-1inhumanuterinelEIomyomacells犴［J］.Di-siJunyiDaxueXuebao，2000;21:36迎3-365.［9］QianJX，Q』ianZQ，HuangYT，LiGY適，WangJB，HuPZ，WangJ慝，Luextravascularmo檻delwithradioac-tiv燼erayinhibitssmooth倮m(xù)usclecellprolifer婿ationandintimalhy-貂perplasiainautogen鐸ousveingraft［J］.Zh齏onghuaYixueZazhi，1愍999;79:19-21.［10］幄ViswanathanM，De-Ol蹉iveiraAM，JohrenO，S散aavedraendothelinE麩Treceptorexpressio具ninratcarotidar-te肚ri