CDR3導(dǎo)向抗體庫(kù)法人源化抗膀胱癌Fab的鑒定

1/1CDR3導(dǎo)向抗體庫(kù)法人源化抗膀胱癌Fab的鑒定CDR3導(dǎo)向抗體庫(kù)法人源化抗膀胱癌Fab的鑒定【摘要】目的:對(duì)通過(guò)CDR3導(dǎo)向抗體庫(kù)法篩選到的3株人源化膀胱癌噬菌體抗體進(jìn)行進(jìn)一步分析鑒定。

方法:用ELISA方法對(duì)篩選特異性克隆進(jìn)行特異性鑒定、抗原表位的核實(shí);采用硫氰酸鹽洗脫ELISA法評(píng)估其親和力;選用活性較高的克隆進(jìn)行膀胱癌組織的免疫組化實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果:3株陽(yáng)性克隆可溶性表達(dá)后能夠與膀胱癌EJ細(xì)胞特異性結(jié)合;與鼠源噬菌體抗體(BDI)相比,2株克隆的親和指數(shù)比較低,均為0.25mol/L,1株克隆的親和指數(shù)為0.7mol/L,略低于鼠源的親和指數(shù)（0.9mol/L）的水平。

選擇活性較高的克隆進(jìn)行膀胱癌組織的免疫組化實(shí)驗(yàn),顯示該克隆能夠與癌組織特異性結(jié)合。

結(jié)論:用CDR3導(dǎo)向庫(kù)法獲得的人源抗體片段基本保持了原鼠源單克隆抗體(mAb)BDI的特性。

【關(guān)鍵詞】抗膀胱癌單克隆抗體噬菌體抗體庫(kù)鼠單克隆抗體人源化單克隆抗體(mAb)在許多領(lǐng)域得到極為廣泛的應(yīng)用,但由于其鼠源性,限制了在臨床治療方面的應(yīng)用,近幾年由于人源化和人源抗體研制技術(shù)的進(jìn)展才得以迅速發(fā)展。

目前,對(duì)鼠mAb進(jìn)行人源化改造有多種方案。

以噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)為基礎(chǔ)的抗原表位定向選擇法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種鼠mAb人源化新方法［1,2］。

該方法通過(guò)鼠-人輕重鏈可變區(qū)雜合配對(duì),用抗原進(jìn)行親和篩選,最終得到與親本鼠mAb識(shí)別相同抗原表位的人源抗體。

該方法能夠確保所篩選到的抗體為人源抗體,不含鼠源序列。

但所獲人源mAb的特異性及親和力難以得到保證,有時(shí)所獲人源抗體與抗原的結(jié)合活性會(huì)產(chǎn)生漂移,與親本鼠mAb有所不同。

CDR3導(dǎo)向抗體庫(kù)法是在抗原表位定向選擇法的基礎(chǔ)上嘗試的一種新方法。

該方法通過(guò)構(gòu)建含鼠mAbCDR3區(qū)基因的人源抗體庫(kù),并利用cre-loxp定位重組系統(tǒng)構(gòu)建大容量抗體庫(kù),直接篩選與親本鼠mAb特異性相同的人源抗體。

運(yùn)用該方法我們嘗試人源化抗膀胱癌鼠mAbBDI,獲得3株人源噬菌體抗體Fab基因,并證實(shí)篩選到的克隆與親本鼠mAb識(shí)別相同的抗原表位［3］。

本研究中,我們將對(duì)其特性作進(jìn)一步分析鑒定。

1材料和方法1.1材料抗膀胱癌噬菌體抗體由本室運(yùn)用CDR3導(dǎo)向抗體庫(kù)法篩選獲得,抗膀胱癌人-鼠嵌合抗體（cBDI）、抗乙肝表面抗原Fab(HBsAgFab)、大腸桿菌菌株、VCSM13、L929細(xì)胞由本室制備保存［4］;抗膀胱癌鼠mAb(BDI)、膀胱癌細(xì)胞株（EJ）由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部泌尿研究所俞莉章教授提供;限制性?xún)?nèi)切酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品;各種酶標(biāo)抗體購(gòu)自Promega公司和Sigma公司。

1.2方法1.2.1可溶性Fab抗體的表達(dá)及檢測(cè)參照文獻(xiàn)［5］介紹的方法構(gòu)建和表達(dá)可溶性Fab抗體,并按照文獻(xiàn)［6］介紹的方法接種膀胱癌EJ細(xì)胞及L929細(xì)胞于96孔板,以HRP-羊抗人Fab為二抗,檢測(cè)上清中人Fab與膀胱癌細(xì)胞的結(jié)合活性及特異性。

1.2.2相對(duì)親和力的測(cè)定（1）測(cè)定硫氰酸銨(NH4SCN)對(duì)EJ細(xì)胞抗原的影響:接種EJ細(xì)胞于96孔板培養(yǎng)過(guò)夜,用2.5mL/L戊二醛或丙酮/無(wú)水乙醇（1∶1）固定細(xì)胞,30g/L的脫脂牛奶-PBS（MPBS）37℃封閉1h,加入不同濃度（0～2.0mol/L）的NH4SCN,室溫靜置15min,PBS洗3次,加入相同濃度的鼠mAb(BDI)和嵌合抗體（cBDI）,50L/孔,37℃孵育1h,0.5mL/LTween-20/PBS洗3次,加入HRP-羊抗鼠或HRP-羊抗人Fab(1∶2000),37℃孵育1h,再經(jīng)洗滌后OPD顯色。

（2）用NH4SCN洗脫法測(cè)定相對(duì)親和力:種植于96孔板的EJ細(xì)胞經(jīng)固定及封閉后,加入待測(cè)抗膀胱癌mAbFab噬菌體上清50L/孔,37℃孵育1h,0.5mL/LTween-20/PBS洗3次,加50L/孔不同濃度的NH4SCN,室溫靜置15min,PBS洗3次,加入HRP-抗M13（1∶5000）37℃孵育2h,再經(jīng)洗滌后OPD顯色,A490計(jì)數(shù)。

抗體與抗原結(jié)合的A490值在經(jīng)洗脫后下降至50%的NH4SCN濃度即為該抗體的親和指數(shù),以mol/L表示［7］。

1.2.3免疫組化實(shí)驗(yàn)取臨床病理確定的膀胱癌標(biāo)本的石蠟切片脫蠟后,蒸餾水洗滌5min3次,將切片放入盛有枸櫞酸鹽的緩沖液（pH6.0）的容器中,置微波爐內(nèi)加熱,在92℃～95℃之間持續(xù)10～15min,室溫冷卻10～20min。

蒸餾水沖洗,PBS浸泡5min。

50g/L山羊血清封閉1h,加入待測(cè)的抗體,4℃冰箱放置過(guò)夜。

次日,PBS沖洗5min3次,加HRP-抗M13或HRP-羊抗人Fab,室溫放置2h,繼續(xù)PBS沖洗5min3次,加入DAB顯色,復(fù)染,封片。

2結(jié)果2.1可溶性Fab抗體的表達(dá)及檢測(cè)將獲得的3株人源抗膀胱癌噬菌體抗體以NheI酶切,除去噬菌體抗體表達(dá)載體中的基因Ⅲ片段,得到可溶性Fab段的表達(dá)質(zhì)粒,用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue,經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)制備可溶性Fab上清,用HRP-羊抗人Fab進(jìn)行ELISA檢測(cè),證明該Fab段能特異地與EJ細(xì)胞結(jié)合（表1）。

表1可溶Fab與EJ細(xì)胞結(jié)合的ELISA（略）2.2相對(duì)親和力的測(cè)定硫氰酸銨洗脫法是比較不同抗體相對(duì)親和力的一種方法［8］。

一般常用于比較可溶性單一抗原的相對(duì)親和力,為確定其是否能夠用于本實(shí)驗(yàn)中,首先檢測(cè)了不同濃度硫氰酸銨對(duì)EJ細(xì)胞的影響。

結(jié)果顯示在2mol/L濃度下,硫氰酸銨對(duì)固相化EJ細(xì)胞的抗原性無(wú)影響（圖1）。

圖1硫氰酸銨對(duì)固相化EJ細(xì)胞抗原的影響（略）在此基礎(chǔ)上現(xiàn)用該方法比較了所獲人源與鼠源BDI噬菌體抗體的相對(duì)親和力,表明經(jīng)過(guò)CDR3引導(dǎo)所獲得的人源抗體陽(yáng)性克隆中,其中的2個(gè)克隆的親和指數(shù)比較低,均為0.25mol/L,1個(gè)克隆的親和指為0.7mol/L,接近于鼠源的親和指數(shù)（0.9mol/L）的水平（圖2）。

圖2抗體相對(duì)親和力的測(cè)定（略）2.3腫瘤組織免疫組化實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步確定所篩選的人源抗體的特異性,現(xiàn)又用確診的膀胱癌組織的石蠟切片進(jìn)行了免疫組化實(shí)驗(yàn),其所篩選到的人源抗膀胱癌抗體能夠與膀胱癌組織特異結(jié)合（圖3）。

圖3免疫組化鑒定人源抗膀胱癌抗體Fab（SP,100）（略）A:正常組織;B:膀胱癌組織.3討論BDI是一株對(duì)膀胱癌細(xì)胞具有高特異、高親和性的抗膀胱癌mAb,在放射免疫診斷和治療試用中取得良好的效果。

為使其更好的用于臨床,在克隆BDI輕、重鏈基因的基礎(chǔ)上,通過(guò)構(gòu)建含鼠mAbBDICDR3區(qū)基因的人源抗體庫(kù),利用cre-loxp定位重組系統(tǒng)構(gòu)建大容量抗體庫(kù)。

用EJ細(xì)胞對(duì)所獲的抗體庫(kù)進(jìn)行篩選,獲得了3株與EJ細(xì)胞具有特異結(jié)合活性的人源化的噬菌體抗體。

與嵌合抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)顯示所獲的噬菌體抗體與親本鼠mAb識(shí)別相同的抗原表位。

通過(guò)對(duì)所獲陽(yáng)性克隆可變區(qū)序列測(cè)定,顯示所獲得的克隆均為人源Fab,抗體的基因與人胚系免疫球蛋白基因庫(kù)中的基因有極高的同源性。

在本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)把得到的3個(gè)克隆表達(dá)為可溶性Fab分子后,ELISA結(jié)果顯示,盡管3個(gè)克隆均能夠與EJ細(xì)胞特異性結(jié)合,只有一株可溶性克隆顯示出較高的特異性,可能是噬菌體抗體利用噬菌體展示技術(shù)將抗體蛋白展示在噬菌體表面,噬菌體表達(dá)的抗體數(shù)量有幾倍得到幾十倍的放大,結(jié)果顯示親和力高［9］。

說(shuō)明盡管用CDR3導(dǎo)向抗體庫(kù)法能夠獲得與鼠mAb識(shí)別相同表位的人源抗體,要想獲得具有高親和力的具有臨床應(yīng)用前景的抗體,還需進(jìn)一步進(jìn)行體外親和力成熟實(shí)驗(yàn)。

在本實(shí)驗(yàn)中,我們還運(yùn)用硫氰酸銨洗脫法比較了所獲人源與鼠源BDI噬菌體抗體的相對(duì)親和力,盡管結(jié)果顯示其中一個(gè)克隆的親和指數(shù)為0.7mol/L,接近于鼠源的親和指數(shù)（0.9mol/L）的水平,由于噬菌體抗體具有一定的放大效應(yīng),要想得到準(zhǔn)確的結(jié)果,還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證,相關(guān)工作正在進(jìn)行中。

【參考文獻(xiàn)】［1］JespersLS,RobertsA,MahlerSM,etal.Guidingtheselectionofhumanantibodiesfromphagedisplayrepertoirestoasingleepitopeofanantigen［J］.BioTechnology,1994,12（9）:899-903.［2］WangZZ,WangY,LiZF,etal.HumanizationofamousemonoclonalantibodyneutralizingTNF-byguidedselection［J］.JImmunolMethods,2000,241(1-2):171-184.［3］周麗君,王琰,王堃,等.用CDR3導(dǎo)向抗體庫(kù)法對(duì)鼠抗人膀胱癌單抗進(jìn)行人源化［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2004,24(2):150-154.［4］白銀,王琰,周麗君,等.抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2001,33（5）:402-406.［5］李竟,王琰,王卓智,等.抗胃癌鼠單抗3H11Fab段載體的構(gòu)建、表達(dá)及抗體活性檢測(cè)［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,1999,19（2）:158-161.［6］周麗君,白銀,王琰,等.抗膀胱癌單抗Fab段基因的克隆及表達(dá)［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2002,9(2):117-121.［7］王剛,王琰.用硫氰酸鹽洗脫法篩選高親和力噬菌體抗體［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志,2002,18（2）:93-95.