ELISA-技術(shù)在禽流感診斷研究中的應(yīng)用

ELISA技術(shù)在禽流感診斷研究中的應(yīng)用摘要：禽流感（AI）是目前禽類流行的主要疫病之一，給養(yǎng)禽業(yè)和人類健康帶來(lái)了巨大危害。由于禽流感病毒血清型眾多，致病疫情多樣，因此，適時(shí)的檢測(cè)和早期快速診斷是預(yù)防和控制禽流感的前提條件。ELISA方法以其特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便，可迅速檢測(cè)大量樣品，使用儀器設(shè)備少，利于基層操作等優(yōu)點(diǎn)成為AI流行病學(xué)普查及早期快速診斷的最實(shí)用和有效的方法。關(guān)鍵詞：禽流感ELISA診斷禽流感（AvianInfluenza，AI）是由A型流感病毒所引起禽類的感染和/或疾病綜合征，1878年首次發(fā)生于意大利，目前已在全世界廣泛流行，被國(guó)際獸疫局確定為A類傳染病。禽流感病毒感染后引起的臨床癥狀和病理變化，因感染禽的種類、年齡、免疫狀況、繼發(fā)或混合感染狀況、病程長(zhǎng)短及感染毒株的毒力等不同而異，易與多種禽類疫病相混淆。因此，諸多高致病性禽流感病毒感染致人死亡的事件使禽流感的防制工作提升到前所未有的公共衛(wèi)生學(xué)高度。禽流感疫情的多樣性和公共衛(wèi)生學(xué)意義，使得禽流感的早期、快速診斷對(duì)于疫病的控制尤為重要，傳統(tǒng)的雞胚分離、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)（HI）等檢測(cè)禽流感的方法，由于敏感性不高或檢驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿足基層檢疫和疫病防制的需要，因此禽流感的確診必需依賴實(shí)驗(yàn)室診斷。ELISA檢測(cè)技術(shù)以其高敏感性、高特異性、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，在畜禽疫病診斷和監(jiān)測(cè)中發(fā)揮了重要作用。1間接ELISA1.1基于全病毒的間接ELISA黃金海等[1]應(yīng)用醛化的雞紅細(xì)胞經(jīng)吸附釋放方法獲得純化的禽流感病毒（H9N2亞型AIV）經(jīng)處理后作為ELISA檢測(cè)方法的包被抗原。并以不同的含量進(jìn)行包被，建立了定量檢測(cè)禽流感抗體水平的間接ELISA方法。該試驗(yàn)建立的ELISA方法不僅可檢測(cè)出血清中禽流感抗體的P/N值，還可用回歸方程算出ELISA效價(jià)，實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定，這為檢測(cè)雞群的抗體水平，制定合理的免疫程序提供了科學(xué)的依據(jù)。1.2基于核蛋白（NP）的間接ELISA禽流感核蛋白具有有型特異性，同型流感病毒核蛋白氨基酸具有很高的同源性，因而純化重組蛋白可以用來(lái)代替全病毒作為ELISA的診斷抗原。用重組核蛋白作為抗原克服了常規(guī)全病毒抗原的許多不利之處，整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中不涉及禽流感病毒，因此生物安全性好，不存在散毒的危險(xiǎn)，而且生產(chǎn)成本低，易于規(guī)?；a(chǎn)。李海燕等[2，3]用表達(dá)禽流感病毒（AIV）核蛋白基因的桿狀病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞，以其表達(dá)產(chǎn)物制備抗原，建立了禽流感間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)（rNP_ELISA）。根據(jù)對(duì)140份SPF雞血清檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，確定其判定標(biāo)準(zhǔn)為OD值大于0.15的血清樣品為陽(yáng)性。用rNP_ELISA檢測(cè)150份SPF雞血清、194份非免疫雞血清及30份其它15種雞疫病陽(yáng)性血清均為陰性；檢測(cè)A型AIV的15個(gè)不同亞型（H1-H15）毒株的特異性血清均為陽(yáng)性；對(duì)人工接種AIV的SPF雞第3d即能檢出抗體，到第162d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)檢測(cè)仍為陽(yáng)性。對(duì)3138份雞血清進(jìn)行監(jiān)測(cè)，rNP_ELISA與全病毒間接ELISA（AIV_ELISA）、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）及血凝抑制試驗(yàn)（HI）的符合率分別為99.9%、97.1%、98.8%；并能100%檢出AGP陽(yáng)性及疑似、HI陽(yáng)性的血清樣品。試驗(yàn)證明，rNP_ELISA是檢測(cè)A型禽流感病毒血清特異性抗體的一種特異、敏感、微量、快速、經(jīng)濟(jì)的血清學(xué)診斷技術(shù)。其并將成熟的禽流感間接ELISA快速診斷技術(shù)試劑盒化，該試劑盒與進(jìn)口禽流感間接ELISA診斷試劑盒對(duì)同樣血清樣品檢測(cè)，符合率為100%。吳仁蔚等[4]以AIV的H9N2亞型全長(zhǎng)NP蛋白為包被抗原，建立了檢測(cè)AIV抗體的間接NP-ELISA方法。對(duì)263份待檢血清（包括臨床收集的243份血清和20份H9N2亞型AIV免疫雞陽(yáng)性血清）進(jìn)行檢測(cè)，NP-ELISA與瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）的總符合率為83.3%，與血凝抑制試驗(yàn)（HI）的總符合率為92%。異性試驗(yàn)表明，NP-ELISA方法可以檢測(cè)H5、H7和H9亞型AIV特異性抗體，檢測(cè)為陽(yáng)性的血清樣品能夠被陽(yáng)性雞胚尿囊液阻斷。敏感性試驗(yàn)證實(shí)NP-ELISA最早可以檢測(cè)雞感染后7d的血清樣品，并于感染后10d確定100%血清陽(yáng)性，而AGP檢測(cè)直到首免后21~28d才出現(xiàn)部分血清陽(yáng)性，HI檢測(cè)直到10~14d才出現(xiàn)部分血清陽(yáng)性，并且NP-ELISA要比HI敏感4~40倍。將禽流感病毒核蛋白（NP）主要抗原域的基因片段（984bp）進(jìn)行表達(dá)純化，用純化的重組蛋白作為包被抗原包被酶標(biāo)板，建立的檢測(cè)禽流感病毒抗體的間接ELISA方法能夠區(qū)分?jǐn)y帶H5N1禽流感病毒血凝素、神經(jīng)氨酸酶和雞白介素-18基因的禽痘病毒活載體疫苗免疫的免疫抗體和AIV全病毒免疫的抗體或自然感染抗體[5]。因此，此方法可以作為該活載體疫苗的一種配套檢測(cè)方法，區(qū)分該活載體疫苗免疫抗體和其他疫苗免疫抗體。以核蛋白（NP）為包被抗原建立的間接ELISA是檢測(cè)AIV血清型特異性抗體的一種特異、敏感、快速、經(jīng)濟(jì)的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)。此技術(shù)不僅克服了以全病毒為包被抗原帶來(lái)的危險(xiǎn)，而且還可以區(qū)分活載體疫苗和其他疫苗免疫的區(qū)別，但是，不能區(qū)別滅活疫苗和自然感染所產(chǎn)生抗體。1.3基于血凝素（HA）的間接ELISA血凝素是位于病毒囊膜表面的一種蛋白質(zhì)，具有亞型特異性，可以誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生。因此，利用HA蛋白作為包被抗原，可以直接鑒定到亞型，省時(shí)、省力、節(jié)約資源。將H9N2亞型禽流感病毒血凝素基因擴(kuò)增、表達(dá)、純化后作為抗原包被酶標(biāo)板建立的檢測(cè)H9亞型禽流感抗體的間接ELISA方法，特異性好，與H5、H7亞型禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清沒有交叉反應(yīng)，同時(shí)與雞其他疫病的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清呈陰性反應(yīng)[6]。敏感性檢測(cè)表明其陽(yáng)性符合率、陰性符合率及總符合與進(jìn)口試劑盒檢測(cè)結(jié)果相比均為100%。說(shuō)明以HA重組蛋白作為診斷H9亞型禽流感抗原具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可用于H9亞型禽流感抗體的檢測(cè)。1.4基于非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1）的間接ELISANS基因編碼2種蛋白質(zhì)，即NS1和NS2，其中NS1蛋白在病毒復(fù)制及早期的抗病毒免疫應(yīng)答中具有重要作用。Skehel進(jìn)一步研究表明，NS1蛋白在病毒復(fù)制的早期就大量表達(dá)，僅出現(xiàn)于病毒感染的細(xì)胞內(nèi)，且能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)NS1蛋白的抗體。這提示NS1蛋白可作為一種鑒別診斷標(biāo)志，通過(guò)檢測(cè)抗NS1蛋白的抗體來(lái)區(qū)分野毒感染和疫苗免疫，并可作為早期感染的依據(jù)。楊濤等[7]采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了禽流感病毒（H5N1）的NS1基因，以經(jīng)過(guò)純化的融合蛋白MBP-NS1蛋白為包被抗原，初步建立了間接ELISA檢測(cè)方法，試驗(yàn)證明融合蛋白MBP-NS1能夠與H5N1亞型AIV活病毒感染康復(fù)鴨血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而不能夠與H5N1亞型AIV滅活疫苗免疫鴨血清發(fā)生反應(yīng)。這為今后建立完善的區(qū)分疫苗免疫與自然感染動(dòng)物的ELISA鑒別診斷方法奠定了基礎(chǔ)。分別以AIVA/goose/Guangdong/2000（H5N1）的NS1蛋白和H5N2亞型禽流感病毒的NS1蛋白作為包被抗原建立間接ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)人工感染AIV和滅活疫苗免疫的SPF雞血清，結(jié)果前者為陽(yáng)性，后者為陰性[8，9]。表明該方法能區(qū)分活毒感染和滅活疫苗免疫雞群，但不具有亞型特異型，具有A型流感的特異性。NS1-ELISA方法的初步應(yīng)用，不僅為生產(chǎn)提供了一種快速、特異、敏感的鑒別診斷方法，為禽流感的早期診斷、適時(shí)監(jiān)控和凈化提供了行之有效的方法。2雙抗體夾心ELISA（DAS-ELISA）肖運(yùn)才等[10]以禽流感病毒（AIV）湖北分離株（H9N2亞型）提純物為免疫原，制備出雞抗AIV和兔抗AIV抗體。以純化的雞抗AIVIgG為包被抗體，兔抗AIVIgG為第2抗體，建立了檢測(cè)AIV抗原的夾心ELISA法。結(jié)果表明，對(duì)已知的陽(yáng)性樣品，用夾心ELISA法測(cè)得的病毒滴度比血球凝集滴度高16倍以上，且能檢出其它亞型的禽流感病毒；與其他禽類傳染病病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明本方法有很高的特異性及敏感性。羅青平等[11]以單克隆抗體2H4為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，以純化的兔血清為第2抗體，建立了快速檢測(cè)AIVH5N1抗原的雙抗體夾心ELISA方法。試驗(yàn)證明該方法對(duì)AIV的檢測(cè)靈敏度達(dá)4.5μg/ml，并與禽流感診斷金標(biāo)準(zhǔn)雞胚分離鑒定作對(duì)比，結(jié)果顯示DAS-ELISA方法與雞胚分離鑒定符合率達(dá)98.2%；并且與其他亞型及禽類常見病毒性疾病無(wú)交叉反應(yīng)。說(shuō)明該方法具有簡(jiǎn)單、快速、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于禽類群體AIVH5N1感染的早期檢疫、實(shí)驗(yàn)室診斷的標(biāo)準(zhǔn)化及流行病學(xué)調(diào)查。肖丹、王曉華等[12，13]以相似的方法建立了檢測(cè)H5亞型的雙夾心ELISA方法，敏感性試、特異性檢驗(yàn)表明，該種方法均較HI試驗(yàn)敏感，且與其他病毒無(wú)交叉反應(yīng)。廖志勇等[14]以H5血凝素和攜帶H5全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒免疫Balb/c小鼠制備mAb，通過(guò)篩選建立了以單克隆抗體H5M9為捕獲抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記單克隆抗體H5M11為檢測(cè)抗體的雙抗體夾心ELISA；檢測(cè)多株H5N1病毒和H5血凝素的最低檢出值為1/32血凝單位，檢測(cè)A型流感病毒H1N1、H3N2、B型流感病毒以及H7、H9血凝素均為陰性。試驗(yàn)證明該方法是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的測(cè)定H5抗原的ELISA捕獲法，可應(yīng)用于禽流感病毒H5N1感染的實(shí)驗(yàn)室早期診斷。雙抗體夾心ELISA方法的建立，病毒的檢出，不僅為禽流感病雞群的臨床檢驗(yàn)提供了一種方便、敏感、快速的檢測(cè)方法，而且為開展流病學(xué)調(diào)查研究奠定了很好的基礎(chǔ)，為最終控制和消滅這種疾病提供可靠依據(jù)和技術(shù)保證，具有很高的使用價(jià)值。3Dot-ELISA以混合纖維素酯微孔濾膜為固相載體，用自制的禽流感全病毒抗原和酶標(biāo)抗體，建立了禽流感抗體斑點(diǎn)-ELISA檢測(cè)法，出現(xiàn)明顯清晰的斑點(diǎn)者判為禽流感抗體陽(yáng)性。該方法對(duì)SPF雞血清及新城疫、傳染性法氏囊病等其它11種雞疫病陽(yáng)性血清均為陰性，對(duì)不同亞型特異性的禽流感病毒（AIV）分型血清、瓊擴(kuò)（AGP）陽(yáng)性血清及血凝抑制（HI）陽(yáng)性而AGP疑似的血清樣品均呈陽(yáng)性；對(duì)人工接種AIV的SPF雞第3d即能檢出抗體陽(yáng)性，第5~117d可全部檢出[15]。張春杰等[16]采用AIV滅活油乳苗（H9N2）對(duì)AIV非免疫雞進(jìn)行接種并獲取高免血清，取高免血清采用飽和硫酸銨沉淀法，經(jīng)過(guò)SephadexG25層析柱提純后獲得純度很好的IgG。將IgG應(yīng)用過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記辣根過(guò)氧化酶（HRP），制備禽流感酶標(biāo)抗體（IgG-HRP），建立了一種優(yōu)化的AIV雙抗夾心Dot-ELISA檢測(cè)法。優(yōu)化后的檢測(cè)方法可在2.5h內(nèi)診斷結(jié)果，制備好的包被膜在4℃下保存2個(gè)月不影響其效果。而且敏感性提高了3倍，與新城疫病毒液、傳染性支氣管炎及減蛋綜合癥病毒液無(wú)交叉反應(yīng)。Dot-ELISA采用混合纖維素酯膜或硝酸纖維素膜代替微量反應(yīng)板，即保留ELISA方法的特異性、敏感性，結(jié)果又不需要特殊儀器分析，可肉眼判定，大大縮短了診斷時(shí)間。與間接ELISA法比較，不僅其特異性、敏感性、重復(fù)性相一致，而且結(jié)果可用肉眼判定，更適合現(xiàn)地禽流感抗體監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。4抗原捕獲ELISA宋建領(lǐng)等[17，18]采用禽流感病毒多克隆抗體及型特異性單克隆抗體，研究建立了型特異性抗原捕捉ELISA檢測(cè)方法，用于檢測(cè)H5N1和H9N2亞型禽流感病毒。結(jié)果表明，采用高純度的特異性多克隆抗體和單克隆抗體，建立的抗原捕捉ELISA，可排除正常雞胚組織或尿囊液的本底干擾，具有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于臨床樣品及雞胚、細(xì)胞培養(yǎng)物中禽流感病毒的檢測(cè)。王傳彬等[19]用親和層析法純化抗禽流感病毒H5亞型血凝素單克隆抗體，包被微量反應(yīng)板，用于捕獲病毒抗原，再用生物素標(biāo)記的單抗和酶標(biāo)親和素來(lái)檢測(cè)病毒血凝素抗原。用該方法檢測(cè)H1-H15亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)毒株和H5、H7、H9亞型AIV分離株，并與血凝和血凝抑制試驗(yàn)比較，評(píng)價(jià)其敏感性和特異性。結(jié)果表明該ELISA反應(yīng)體系能檢出H5N3標(biāo)準(zhǔn)株和所有20株國(guó)內(nèi)H5亞型AIV分離株，而與其他14個(gè)血凝素亞型的AIV標(biāo)準(zhǔn)株、15個(gè)H9亞型AIV分離株和2個(gè)H7亞型AIV分離株均無(wú)交叉反應(yīng)。曹振等[20]以禽流感病毒（AIV）H5亞型分離株A/Chicken/GuangdongSZ/1/00（H5N1）作為免疫原，建立了通過(guò)生物素-親和素放大系統(tǒng)的單抗-生物素捕獲ELISA檢測(cè)方法，取得了與王傳彬[9]相似的試驗(yàn)結(jié)果。另外，采用H5（H7）亞型多克隆抗體（羊血清）作為捕獲抗體，H5（H7）亞型HA特異性單克隆抗體為檢測(cè)抗體純化，建立了檢測(cè)H5（H7）亞型禽流感病毒的抗原捕捉ELISA方法，和其他禽類病毒以及其他亞型禽流感病毒均沒有明顯的交叉反應(yīng)性[21，22]，說(shuō)明該方法對(duì)H5（H7）亞型高致病性禽流感病毒具有很好的特異性。5小結(jié)自1994年在廣東省首次分離到H9N2亞型禽流感病毒以來(lái)，先后在家禽體內(nèi)分離獲得了H5N1、H5N2（中國(guó)臺(tái)灣）等多種禽流感病毒。中國(guó)香港、泰國(guó)、越南暴發(fā)的H5N1、H9N2亞型禽流感，出現(xiàn)了病毒突破種間屏障感染人的病例，賦予了禽流感全新的公共衛(wèi)生意義。對(duì)于禽流感的防控措施，主要有2種形式，一種是采取以撲殺和生物安全方法為主的防控措施；另一種是采取撲殺、強(qiáng)制性免疫和生物安全方法相結(jié)合為主的撲滅措施，我國(guó)屬于后者。因此，對(duì)于禽流感的及時(shí)監(jiān)測(cè)、診斷，在禽流感的防控上就尤為重要。目前，對(duì)于禽流感的監(jiān)控，主要是抗體的檢測(cè)和病毒的分離兩方面，ELISA是AI流行病學(xué)普查及早期快速診斷的一種有效和實(shí)用的方法。不同包被抗原的間接ELISA方法，不僅可以檢測(cè)禽流感抗體水平，還可以進(jìn)一步區(qū)分不同亞型病毒感染，疫苗免疫還是活病毒自然感染產(chǎn)生的抗體。雙抗體夾心ELISA、抗原捕獲ELISA方法的建立，自然感染病毒的查獲，使得對(duì)于禽流感的診斷能進(jìn)一步及早發(fā)現(xiàn)、能最大限度的縮小范圍，及早控制疫情。Dot-ELISA的建立可以使檢測(cè)工作在基層檢疫部門更容易的推廣進(jìn)行，更有利于禽流感的時(shí)時(shí)監(jiān)控。雖然目前國(guó)內(nèi)建立了多種ELISA檢測(cè)方法，但大多數(shù)還是停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，完善的、商品化的ELISA檢測(cè)試劑盒還沒有很好的開發(fā)推廣；對(duì)于建立ELISA檢測(cè)方法的抗原、抗體、信號(hào)放大系統(tǒng)、干擾因素去除等方面還有不盡完善的方面，這些都還有待改進(jìn)。參考文獻(xiàn)1黃金海，王英珍，丁伯良，等.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25（4）：111~113.2李海燕，于康震，辛?xí)怨?，?中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22（3）：182~185.3李海燕，于康震，辛?xí)怨?，?中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，23（5）：372~376.4吳仁蔚，胡思順，肖運(yùn)才，等.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37（10）：1067~1072.5方忠意.H5亞型禽流感病毒核蛋白主要抗原域的表達(dá)及其間接ELISA方法的建立[碩士論文].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.6張瑞華，金梅林，王貴華，等.生物工程學(xué)報(bào)，2005，21（2）：315~762008年第6期Culture，2006，85：11~21.4RoyJK，LakshikumaranMS，BalyanHS，etal.BiochemGenetics，2004，42（1/2）：43~59.5MartinB，F(xiàn)riedrichUH，MelchingerAE.CropSci，1999，39：228~237.6VenkateswarluM，UrsSR，NathBS，etal.TreeGenetics&Genomes，2006，3：15~24.7CulleyTM，SbitaSJ，WickA.AnnalsofBotany，2007，100：91~100.8解新明，盧小良.草業(yè)科學(xué)，2005，2（22）：30~37.9蔣彩虹，王元英，孫玉合.中國(guó)煙草科學(xué)，2007，28（2）：1~5.10謝佳燕，張知彬.獸類學(xué)報(bào)，2004，1（24）：71~77.11BornetB，AntoineE，etal.JPhycol，2005，41：704~711.12SpagnuoloV，MuscarielloL，CozzolinoS，etal.PlantEcol，2007，188：91~101.13肖海峻，孟利前，李玉冰.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2006（4）：31~33.14ChartersYM，Robe