桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)概述及策略優(yōu)化

重組蛋白表達(dá)之——桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體系統(tǒng)Baculovirusexpressionvectorsystem,BEVS北京義翹神州科技股份有限公司CONTENT義翹神州簡介1昆蟲與桿狀病毒2BEVS與重組表達(dá)3案例展示4義翹神州義翹神州簡介01義翹神州全球布局北京總部上海分公司歐洲子公司德國法蘭克福美國子公司賓夕法尼亞州費(fèi)城區(qū)蘇州子公司泰州子公司廣州分公司日本子公司義翹神州義翹神州簡介OurPeople820+Employees&Growing30%ofStaffwithMastersorPhDDegreesPrimaryFacility~30,000

m2

Lab/OfficeSpace~4,000m2

GMPFacilityCore

BusinessReagents:RecombinantProteins,Antibodies,cDNAClones,ELISAKits…CustomServices:RecombinantExpression,AntibodyDevelopment…主要資質(zhì)Certifiedby:ISO9001ISO13485CNAS義翹神州義翹神州簡介一站式科研試劑供應(yīng)商32,000+Genes14,000+Antibodies500+ELISAKits6,500+ProteinsEnd-Usersin90+Countries產(chǎn)品大類文獻(xiàn)引用次數(shù)用戶分布>1700citationsin2020CitationsforSARSCOV2relatedproducts(asof5-31-2021):22publishedpapersin“Cell”15publishedpapersin“Science”8publishedpapersin“Nature”義翹神州義翹神州簡介完善的CRO服務(wù)平臺RecombinantProteinProductionServicesMammalianCells,InsectCells,E.coliAvailableRecombinantAntibodyProductionServices

High-throughputAntibodyProductionServiceLarge-scaleAntibodyProductionServiceAntibodyDevelopmentPlatformsRecombinantProductionPlatformsE.coliSystemHEK293/CHOTransientSystemBaculovirus-insectSystemCHO/HEK293StableCellLineDevelopmentMousemAbDevelopment(Hybridoma)RabbitmAbDevelopment(PhageDisplay)SingleB-cellBasedPlatformRabbitpAbDevelopmentAntibodyDevelopmentServicesFastMousemAbDevelopmentRabbitmAbDevelopmentFastRabbitpAbDevelopment

Anti-idiotypeAntibodyDevelopment義翹神州簡介義翹神州桿狀病毒與昆蟲細(xì)胞02義翹神州桿狀病毒：一類具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，以節(jié)肢動物為專一性宿主。表達(dá)用桿狀病毒通常是Autographa

californicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV)Chambersetal:doi:10.1002/cpps.47LifeCycleExpressionStartPromotersHoursPostInfectionInfectionDNAReplicationVirionProductionCellLysisImmediateEarly(0-6hpi)ie0ie1ie2DelayedEarly(3-6hpi)39kLate(3-24hpi)p6.9(basic)vp39VeryLate(18-24to72hpi)polyhedrinp10義翹神州桿狀病毒與昆蟲細(xì)胞桿狀病毒發(fā)展重要節(jié)點(diǎn)：19831ProductionofHumanBetaInterferoninInsectCells1993BAC-to-BACExpressionSystem1953Firstcomprehensivereviewofbaculoviruschemistryandbiochemistry1962Establishedcellstrainsfromtissueculturedinvitro1971Discoveryandidentificationofthebaculovirus,Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus1972ThestructureofNuclearPolyhedrosisVirusesI.Theinclusionbody1973AcMNPVwasisolated1978~1992Analysisofbaculovirusgenomesandusedtodeveloptherecombinantbaculovirusvectors2008~2019flashBac2011~2016geneticengineeringofbaculovirusThestorycontinues…2007~2017Insectcellengineering義翹神州桿狀病毒與昆蟲細(xì)胞昆蟲細(xì)胞發(fā)展重要節(jié)點(diǎn)：1983Establishmentofsf9（Spodopterafrugiperda）1994EstablishmentofTn-5B1-4（HighFive）（Trichopulsiani）1915spermatidfromSamiaceropia1915~1958

Exploreinsectcellcultureinvitro1959Establishmentofovariancellline(Bombyxmori)1962Establishmentofovariancellline(Antheraeaeucalypti)1970Establishmentofsf21（Spodopterafrugiperda）1986EstablishmentofTn-5B1（Trichopulsiani）2010EstablishmentofAo38Thestorycontinues…義翹神州桿狀病毒與昆蟲細(xì)胞常用昆蟲細(xì)胞細(xì)胞系來源應(yīng)用sf-9Spodopterafrugiperdasf-9(Pupalovariantissue)重組桿狀病毒生產(chǎn)蛋白表達(dá)空斑分析sf-21Spodopterafrugiperdasf-21(Pupalovariantissue)胞內(nèi)蛋白表達(dá)分泌蛋白表達(dá)HighFiveTrichopulsiani

(Embryo)

胞內(nèi)蛋白表達(dá)分泌蛋白表達(dá)不同細(xì)胞株蛋白產(chǎn)量差異義翹神州桿狀病毒與昆蟲細(xì)胞BEVS與重組表達(dá)03義翹神州昆蟲-桿狀病毒與其他表達(dá)系統(tǒng)的比較：經(jīng)濟(jì)快速高產(chǎn)量大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)無后修飾包涵體難表達(dá)大分子蛋白酵母表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)快速非人源糖基化高甘露糖修飾BEVS后修飾高產(chǎn)量高細(xì)胞密度可溶表達(dá)周期長大分子蛋白周期長成本高哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)修飾完全可溶表達(dá)周期長成本高義翹神州BEVS與重組表達(dá)應(yīng)用場景重組蛋白的應(yīng)用生物藥結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究天然vs重組蛋白天然蛋白重組蛋白豐度豐度低無豐度限制動物源有無動物源產(chǎn)率低高批間差高可控andsomuchmore…工業(yè)酶催化生物材料藥物開發(fā)VLP/亞單位疫苗開發(fā)診斷試劑義翹神州BEVS與重組表達(dá)表達(dá)流程義翹神州BEVS與重組表達(dá)重組表達(dá)技術(shù)關(guān)鍵因素宿主細(xì)胞純化方法（柱層析）

蛋白質(zhì)/抗體的理化性質(zhì)決定純化方案的設(shè)計

蛋白關(guān)鍵理化指數(shù)：純化標(biāo)簽（親和層析），分子量（蛋白大?。?，等電點(diǎn)（電性電勢分布），疏水性…

常用純化介質(zhì)：親和，離子交換，分子篩，疏水層析，吸附層析，反向…/chemistry/differential-extraction-chromatography/表達(dá)載體（質(zhì)粒）

線性雙鏈DNA分子

啟動子：基因轉(zhuǎn)錄起始處MCS：插入目的基因

抗性基因：輔助篩選細(xì)胞系應(yīng)用sf-9重組桿狀病毒生產(chǎn)胞內(nèi)蛋白表達(dá)空斑分析sf-21胞內(nèi)蛋白表達(dá)分泌蛋白表達(dá)Hi-5胞內(nèi)蛋白表達(dá)分泌蛋白表達(dá)義翹神州BEVS與重組表達(dá)昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基義翹神州BEVS與重組表達(dá)酶轉(zhuǎn)錄因子超大蛋白跨膜蛋白病毒結(jié)構(gòu)蛋白適用BEVS的蛋白類型分泌蛋白復(fù)合體BEVS與重組表達(dá)義翹神州案例展示04義翹神州重組表達(dá)策略制定ProteinIDAccession#(UniPortorNCBI)AA/cDNAsequenceBasicparametersStructuralFeaturesReferenceDisordernessCyscontentS-SprofileHydrophobicitydistributionInstabilityprofileAssessmentMw,pI…TM,PTM,domainsConstructconstruct,affinitytag,QCmethodsandstandardsPilotPOCScale-upFeasibilityassessmentTrouble-shootingFormulation,activity,stability…蛋白最終應(yīng)用決定表達(dá)和純化策略義翹神州案例展示構(gòu)建設(shè)計方案截去影響蛋白表達(dá)的區(qū)段Construct1Construct2

單次跨膜蛋白胞外區(qū)(MW=~90KDa)

昆蟲細(xì)胞表達(dá)

純化分泌蛋白

刪去N端高疏水區(qū)促進(jìn)蛋白分泌表達(dá)功能區(qū)域串聯(lián)表達(dá)Full-length(2511AA)，~70%purity,Yield<0.5mg/LEnoylreductase+Ketoacylreductase(~1000AA)Methyltransferase+Ketoreductase(~700AA)>90%purity,Yield>20mg/L

重組人脂肪酸合成酶（FASN）

多功能域復(fù)合酶昆蟲細(xì)胞表達(dá)純化胞內(nèi)蛋白

通過功能區(qū)串聯(lián)獲得高產(chǎn)重組蛋白義翹神州案例展示雜交瘤制備義翹神州Buffer:PBSDetergentformula1Buffer:PBSDetergentformula2Buffer:PBSDetergent:DDMNi-affinitypurificationNi-affinitypurificationSECpurification案例2:不同buffer蛋白對純化的影響案例展示整體策略優(yōu)化義翹神州

重組表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子蛋白

蛋白高度無序，穩(wěn)定性差

昆蟲細(xì)胞表達(dá)純化胞內(nèi)蛋白

構(gòu)建、培養(yǎng)和純化過程綜合優(yōu)化Construct1:Nt-GST-TF,pilotN端融合標(biāo)簽觀察到目標(biāo)蛋白表達(dá)

目標(biāo)蛋白未GSH梯度洗脫

目標(biāo)蛋白降解嚴(yán)重Construct2:Nt-TF-GST,pilot(V1)Construct2:Nt-TF-GST,scale-up

培養(yǎng)體積=10XV1

蛋白降解

培養(yǎng)體積=V1

收