生物等效性實驗生物樣品處理注意事項

生物等效性實驗生物樣品處理注意事項一、樣品采集后的的處理和貯存鑒于生物樣本的特點，為了避免樣品中被測藥物發(fā)生分解或產(chǎn)生其他化學(xué)變化，取樣后最好立即進(jìn)行分析測定，但實際工作中幾乎無法做到，常需將收集到的樣品冷藏、冰凍，臨用前再融化并放至室溫后使用。在樣本冷凍貯藏前，需及時進(jìn)行處理。1.1血液樣本處理注意事項1.1.1.在肌肉注射或靜脈輸含有葡萄糖或電解質(zhì)(含鉀、鈉、氯離子)的液體時，建議3小時以后采集靜脈血樣本進(jìn)行這些項目的檢驗，以防止上述檢驗項目因輸液引起的假性升高。1.1.2保定非麻醉狀態(tài)的動物時應(yīng)盡量避免用力擠壓動物頭頸和胸腹，以免引起血液淤滯，局部組織缺氧，造成血液某些成分的改變，特別是測定乳酸，血液含氧量等指標(biāo)時。1.1.3血液中紅細(xì)胞內(nèi)外成分有很大差異，溶血可造成紅細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移，如K+、Mg2＋和某些酶類(LD、AST、ALT、ACP)；另外，溶血還可干擾某些化學(xué)項目(TBil、DBil、TC等)的測定，嚴(yán)重影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，血樣本應(yīng)防止溶血。引起溶血的原因有：注射器采血時抽吸力太大；血液與抗凝劑比例失調(diào)；混勻樣本時過度振蕩；注射器或采血容器帶水或容器污染；全血放置時間長或突然受冷或受熱；注射器中的血沫注入采血容器；真空采血時如未采滿至相應(yīng)刻度，殘存負(fù)壓造成紅細(xì)胞破裂；不拔針頭直接注入采血容器；樣本離心時離心力過大等。為避免溶血，取血時應(yīng)注意：①、抽拉注射器時應(yīng)盡量避免注射器內(nèi)產(chǎn)生大量真空；②、添加抗凝劑后的容器在除必要干燥流程后應(yīng)及時密封；③、混勻樣本時避免用力過度，切勿產(chǎn)生泡沫；④、避免重復(fù)使用注射器、針頭、采血管、毛細(xì)玻璃管等一次性用品，手術(shù)刀片和剪刀等器材取材時盡量洗去殘留血液；⑤、采血時的室溫應(yīng)控制在22℃至25℃，采取的血液容器在需要放入冰盒時，切勿緊貼冰袋，冰水；⑥、當(dāng)注射器內(nèi)因吸入空氣產(chǎn)生血沫時，注意棄掉血沫，在將血液注入采血容器時勿將血沫一并注入；⑦、使用真空采血管需抽取負(fù)壓時切勿過量；⑧、將血液注入采血容器時要除去針頭，輕柔推入；⑨、離心帶有血細(xì)胞的血樣時，按照規(guī)格設(shè)定離心參數(shù)；1.1.4.正確選擇采集管。通常情況下多采用血清為樣本(不抗凝)，部分檢測項目需注意樣本屬性為血清或血漿，兩者不可替代。一些特殊檢驗項目需要使用抗凝劑時，應(yīng)注意選擇合適的抗凝劑并注意抗凝劑與血液的比例，以防止樣本凝血或紅細(xì)胞形態(tài)的改變；抗凝血樣本采集后立即輕輕搖勻至少上下顛倒8次，以防凝血發(fā)生。1.1.5.多項化驗采血順序：血培養(yǎng)瓶(厭氧瓶優(yōu)先)→藍(lán)帽管→黑帽管→紅/黃帽管→綠帽管→紫帽管→灰帽管→其他。1.1.6需要凍存的全血按要求分裝到統(tǒng)一規(guī)格的無菌凍存管中，加入DMSO混合均勻后將凍存管放入4℃冰箱中半小時，再放入-20℃冷凍冰箱中，至少4小時候后，才能轉(zhuǎn)移到-80℃或更低溫條件下儲存。1.1.7抗凝收集的血漿冷凍保存后，解凍時可能會出現(xiàn)絮狀渾濁，如有則需要離心去除雜質(zhì)再進(jìn)行檢測。1.2尿液、糞便樣本處理注意事項1.2.1尿液主要是水、尿素、鹽類及少量小分子蛋白，是理想的細(xì)菌生長液，因此應(yīng)在取樣后立即測定。不能立即測定時，應(yīng)于4℃冷藏，如在室溫保存，則應(yīng)在采樣后的尿液中加入少量防腐劑甲苯（1%）或氯仿（飽和）。樣本留取過程中應(yīng)避免混有血、膿或陰道分泌物、糞便等可引起“假性蛋白尿”的成分。檢測非蛋白類待測物時，可根據(jù)試劑盒需求進(jìn)行蛋白沉降操作（離心/化學(xué)沉淀）。用于一些血液病的樣本應(yīng)注意在留尿前勿對動物進(jìn)行酒精涂抹、吸入，注射巴比妥類、磺胺類、利眠寧、眠爾通、苯妥英鈉等藥物，樣本應(yīng)避光保存。1.2.2糞便樣本應(yīng)盡量使用新鮮樣本，采集后立即送檢。若樣本久置，則會因pH及消化酶等因素而使糞便中生物成分分解破壞。樣本中不可混有尿液，更不可采取浸泡于尿液中的糞便樣本。樣本中不可混入墊料、污水等，減少微生物和顆粒造成的影響。糞便樣本不應(yīng)用衛(wèi)生紙包裹、手指抓取，應(yīng)使用棉簽，干凈的鑷子等夾取，直接裝入蠟紙盒或EP管并密封，以防水分丟失。1.3骨髓樣本處理及注意事項骨髓樣本一般通過脊柱穿刺、股骨采取。采集的骨髓液收集于無菌肝素抗凝管內(nèi)，取材環(huán)境應(yīng)保持潔凈（至少為SPF環(huán)境）。若骨髓標(biāo)本含有紅細(xì)胞，在冷凍前應(yīng)先將其離心去除。骨髓標(biāo)本采集后應(yīng)盡快根據(jù)凍存程序并儲存在-80℃環(huán)境下。1.4胃腸液樣本處理及注意事項取材前應(yīng)禁食12小時，在空腹?fàn)顟B(tài)下取材。取出胃腸組織時，應(yīng)夾閉賁門和幽門，及腸道切口兩端，避免腸液胃液流失/混入血液。需要灌洗腸胃時應(yīng)注意灌洗液體積、回收率。肺泡灌洗液樣本同上處理。1.5臟器樣本處理及注意事項取材后應(yīng)迅速將臟器稱重，以免水分蒸發(fā)造成差異，特別是腎上腺等小器官的稱重。臟器稱重前應(yīng)盡量將周圍脂肪組織和結(jié)締組織剔除，并用濾紙吸去臟器表面血液及體液，特別是腎上腺、甲狀腺、前列腺等較小的器官，更要新鮮稱重，防止器官干燥失水而重量減輕。空腔器官稱重前，應(yīng)清除其腔內(nèi)液體，如心臟應(yīng)除去血塊。1.6組織勻漿樣本處理及注意事項勻漿介質(zhì)的制備一般采用pH7.4,0.01mol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖,0.8%氯化鈉溶液或直接用0.86%的生理鹽水作為勻漿介質(zhì)。ELISA檢測的勻漿介質(zhì)可使用PH=7.2-7.4，濃度為0.01mol的PBS。酶活性類檢測則必須使用生理鹽水。三、各類檢測項目注意事項激素類：包括類固醇（腎上腺皮質(zhì)素、性激素）、蛋白質(zhì)和多肽類（垂體、下丘腦、胰腺）、脂肪酸衍生物（白細(xì)胞三烯、前列腺素）、氨基酸衍生物（腎上腺素、甲狀腺素）。在室溫條件下大致穩(wěn)定性從高到低為：固醇類（數(shù)周至數(shù)天）→蛋白質(zhì)和多肽（數(shù)周至數(shù)分鐘）→氨基酸衍生物（數(shù)天至數(shù)分鐘）→脂肪酸衍生物（數(shù)天至數(shù)秒）。檢驗按照檢驗項目的特性取材即刻檢測，或是選擇-70℃凍存，避免反復(fù)凍融，且避免水浴時間過長，建議凍融即開始檢測（注意吹打混勻）。蛋白類：包括酶、抗體、表面標(biāo)示蛋白、總蛋白組織液、泛素、部分激素類等。在-70℃中相對保存時間較長，但反復(fù)凍融極易破壞穩(wěn)定性，水浴更容易被細(xì)菌或樣本內(nèi)自身的酶降解。其中抗體類蛋白最為穩(wěn)定，IgG甚至能在血清中4℃穩(wěn)定保存23天。而酶類在血清中4℃放置8小時即會造成活性下降。血清蛋白則能在24小時內(nèi)保持穩(wěn)定。多肽類：根據(jù)分子量大小，較長的肽鏈穩(wěn)定性能與蛋白相當(dāng)，分子量越小則穩(wěn)定性越差，血清樣本建議24小時內(nèi)檢測處理，-70℃凍存時應(yīng)避免反復(fù)凍融。氨基酸：在中性條件下可在-70℃至-20℃凍存數(shù)月，但4℃以上開始，血清樣本中氨基酸會緩慢被酶代謝，在酶類豐富的組織液和細(xì)胞裂解液中更容易代謝。建議加快凍融復(fù)溫后的檢驗進(jìn)程。生化類檢測項目：這些檢驗項目較為復(fù)雜，除了部分有機(jī)鹽類之外，大部分易受氧化、光照分解、生物降解?？紤]到實驗室方法學(xué)允許誤差，參考檢驗科對具體項目的測定要求：GLU應(yīng)在4

h內(nèi)測定，BUN（尿素氮）、TBIL（總膽紅素）應(yīng)在8

h內(nèi)完成，TP（總蛋白）、ALB（白蛋白）、ALT（丙谷氨酸轉(zhuǎn)移酶）、AST（天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶）、ALP（堿性磷酸酶）、GGT（GGT谷氨?；D(zhuǎn)移酶）、Ca2+、PT應(yīng)在24

h內(nèi)測定完。血液標(biāo)本長時間放置后，其結(jié)果偏高的是：TP、ALB、ALT、AST、ALP、GGT、Ca2+；其結(jié)果偏低的是：BUN、TBIL；對結(jié)果影響差異無顯著性的是：TG（甘油三酯）、DBIL（直接膽紅素）。這提示，要得到血脂等指標(biāo)的可靠準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，標(biāo)本也不適宜在低溫下長時間保存。正是由于血液放置時間對有些生化檢驗項目的影響，對于工作量大的生化室應(yīng)先測定不宜長時間放置的標(biāo)本，而不能及時測定的項目應(yīng)把血清分離出來后放置2-8