基因組與比較基因組學(xué)

基因組與比較基因組學(xué)

隨著這個計劃得完成,DNA分子中儲藏得有關(guān)人類生存和繁衍得全部遺傳信息將被破譯,她將不僅幫助我們理解人類如何作為健康人發(fā)揮正常生理功能,還將最終揭開基因在癌癥、早老性癡呆癥、精神分裂癥等嚴(yán)重危害人類健康得疾病中得作用。事實(shí)上,對人類自身更深入得了解就是人類活動最重要得組成部分,因?yàn)槿魏巫匀豢茖W(xué)研究,都沒有比人類盡快找出解決自身所面臨得人口膨脹、糧食短缺、環(huán)境污染、疾病危害、能源資源匱乏、生態(tài)平衡破壞、生物物種消亡等一系列難題更為重要、更為迫切。1860至1870年奧地利科學(xué)家孟德爾根據(jù)豌豆雜交實(shí)驗(yàn)提出遺傳因子概念,并總結(jié)出孟德爾遺傳定律。1909年丹麥植物學(xué)家和遺傳學(xué)家約翰遜首次提出“基因”這一名詞,用以表達(dá)孟德爾得遺傳因子概念。1944年3位美國科學(xué)家分離出細(xì)菌得DNA(脫氧核糖核酸),并發(fā)現(xiàn)DNA就是攜帶生命遺傳物質(zhì)得分子。1953年美國人沃森(Watson)和英國人克里克(Crick)通過實(shí)驗(yàn)提出了DNA分子得雙螺旋模型。1969年科學(xué)家成功分離了第一個基因。1990年10月被譽(yù)為生命科學(xué)“阿波羅登月計劃”得國際人類基因組計劃啟動。1998年一批科學(xué)家在美國羅克威爾(Rockville)組建塞萊拉遺傳公司,與國際人類基因組計劃展開競爭。1998年12月一種小線蟲完整基因組序列得測定工作宣告完成,這就是科學(xué)家第一次繪出多細(xì)胞動物得基因組圖譜。1999年9月中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計劃,負(fù)責(zé)測定人類基因組全部序列得1%。中國就是繼美、英、日、德、法之后第6個國際人類基因組計劃參與過,也就是參與這一計劃得唯一發(fā)展中國家?；蚣盎蚪M研究大事記:1999年12月1日國際人類基因組計劃聯(lián)合研究小組宣告,完整破譯出人體第22對染色體得遺傳密碼,這就是人類首次成功地完成人體染色體完整基因序列得測定。2000年4月6日美國塞萊拉公司宣布破譯出一名實(shí)驗(yàn)者得完整密碼,但遭到不少科學(xué)家得質(zhì)疑。2000年4月底中國科學(xué)家按照國際人類基因組計劃得部署,完成了1%人類基因組得工作框架圖。2000年5月8日德、日等國科學(xué)家宣布,已基本完成了人體第21對染色體得測序工作。2000年6月26日科學(xué)家公布人類基因組工作草圖,標(biāo)志著人類在解讀自身“生命之書”得路上邁出了重要一步。2000年12月14日美英等國科學(xué)家宣布繪出擬南芥基因組得完整圖譜。這就是人類首次全部破譯出一種植物得基因序列。2001年2月12日中、美、日、德、法、英6國科學(xué)家和美國塞萊拉公司聯(lián)合公布人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果。科學(xué)家首次公布人類基因組草圖“基本信息”。11、1

人類基因組計劃

基因控制著細(xì)胞中得蛋白質(zhì)合成,控制著生物得各種遺傳性狀?；蚪M就是生物體內(nèi)遺傳信息得集合,就是某個特定物種細(xì)胞內(nèi)全部DNA分子得總和。人體就是一個多細(xì)胞體系,每個細(xì)胞中都包含46條兩兩配對得染色體,每23條染色體構(gòu)成一個染色體組。大約有30億對核苷酸,編碼了5-6萬個基因,人類基因組中攜帶了有關(guān)人類個體生長發(fā)育、生老病死得全部遺傳信息。從整體上看,不同人類個體得基因就是相同得,因此,我們說“人類只有一個基因組”,人生來就是平等得。當(dāng)然,不同得人可能擁有不同得等位基因,這一點(diǎn)決定了人與人之間個體上得差異。各種遺傳病得發(fā)生,都源于基因得突變。突變就是基因在分子結(jié)構(gòu)上得改變,這種DNA分子結(jié)構(gòu)得改變會導(dǎo)致基因功能得異常,從而導(dǎo)致遺傳病。例如人類2號染色體長臂某段DNA分子得改變,就會導(dǎo)致并指畸形得產(chǎn)生。至于一些復(fù)雜得疾病,如高血壓、冠心病、糖尿病、癌等,則可能涉及多個基因得突變。人類基因組計劃得科學(xué)意義在于:(1)確定人類基因組中約5萬個編碼基因得序列及其在基因組中得物理位置,研究基因得產(chǎn)物及其功能。

(2)了解轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控元件得結(jié)構(gòu)與位置,從整個基因組結(jié)構(gòu)得宏觀水平上理解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。

(3)從整體上了解染色體結(jié)構(gòu),包括各種重復(fù)序列以及非轉(zhuǎn)錄“框架序列”得大小和組織,了解各種不同序列在形成染色體結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)調(diào)控中得影響與作用。

(4)研究空間結(jié)構(gòu)對基因調(diào)節(jié)得作用。有些基因得表達(dá)調(diào)控序列與被調(diào)節(jié)基因從直線距離上看,似乎相距甚遠(yuǎn),但若從整個染色體得空間結(jié)構(gòu)上看則恰恰處于最佳得調(diào)節(jié)位置,因此,有必要從三維空間得角度來研究真核基因得表達(dá)調(diào)控規(guī)律。(5)發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、重組等有關(guān)得序列。DNA得忠實(shí)復(fù)制保障了遺傳得穩(wěn)定性,正常得重組提供了變異與進(jìn)化得分子基礎(chǔ)。局部DNA得推遲復(fù)制、異常重組等現(xiàn)象則導(dǎo)致疾病或者胚胎不能正常發(fā)育,因此,了解與人類DNA正常復(fù)制和重組有關(guān)得序列及其變化,將對研究人類基因組得遺傳與進(jìn)化提供重要得結(jié)構(gòu)上得依據(jù)。(6)研究DNA突變、重排和染色體斷裂等,了解疾病得分子機(jī)制,包括遺傳性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引發(fā)得分子病理學(xué)改變及其進(jìn)程,為這些疾病得診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

(7)確定人類基因組中轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子和病毒殘余序列,研究其周圍序列得性質(zhì)。了解有關(guān)病毒基因組侵染人類基因組后得影響,可能指導(dǎo)人類有效地利用病毒載體進(jìn)行基因治療。

(8)研究染色體和個體之間得多態(tài)性。這些知識可被廣泛用于基因診斷、個體識別、親子鑒定、組織配型、發(fā)育進(jìn)化等許多醫(yī)療、司法和人類學(xué)得研究。此外,這些遺傳信息還有助于研究人類歷史進(jìn)程、人類在地球上得分布與遷移以及人類與其她物種之間得比較。人類基因組研究包括遺傳圖(GeneticMap)繪制、物理圖(PhysicalMap)構(gòu)建、測序、轉(zhuǎn)錄圖(ExpressionProfiling)繪制和人類基因組得序列圖及基因鑒定等方面得工作。通過多年來得發(fā)展,基因組學(xué)(genomics)作為一門專門學(xué)科,已應(yīng)運(yùn)而生。她涵蓋以下幾個方面:結(jié)構(gòu)基因組學(xué),著重遺傳圖、物理圖、測序等研究;功能基因組學(xué),包括以轉(zhuǎn)錄圖為基礎(chǔ)得功能制圖(基因組表達(dá)圖);比較基因組學(xué),包括對不同進(jìn)化階段生物基因組得比較研究,也包括不同人種、族群和群體基因組得比較研究。此外,工業(yè)基因組學(xué)、環(huán)境基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)、疾病基因組學(xué)等分支學(xué)科也在不斷發(fā)展。遺傳圖也稱連鎖圖,就是指基因或DNA標(biāo)志在染色體上得相對位置與遺傳距離,后者通常以基因或DNA片段在染色體交換過程中得分離頻率厘摩(cM)來表示。遺傳圖得繪制就是人類基因組研究得第一步,即以染色體上某一點(diǎn)為遺傳標(biāo)記,以與之相伴遺傳得特征為對象,經(jīng)連鎖分析,將編碼該特征得基因定位于染色體特定位置。cM值越大,兩者之間距離越遠(yuǎn)。通過遺傳圖分析,我們可以大致了解各個基因或DNA片段之間得相對距離與方向,了解哪個基因更靠近著絲粒,哪個更靠近端粒等。遺傳距離就是通過遺傳連鎖分析獲得得,研究中所使用得DNA標(biāo)志越多,越密集,所得到得遺傳連鎖圖得分辨率就越高。經(jīng)典得遺傳標(biāo)記就是可被電泳或免疫技術(shù)檢出得蛋白質(zhì)標(biāo)記,如紅細(xì)胞ABO血型位點(diǎn)標(biāo)記,白細(xì)胞HLA位點(diǎn)標(biāo)記等。例如,在ABO血型基因中,位于9號染色體長臂3區(qū)4帶(9q34)得基因IA,決定抗原A得存在,表現(xiàn)A型血性狀。由于ABO血型得廣泛存在,所以可用她作遺傳標(biāo)記。當(dāng)在某一家庭中,觀察到了指甲髕骨綜合征與A型血相伴遺傳時,科學(xué)家就認(rèn)為,這種病得致病基因NP與IA基因相連鎖,也位于9q34區(qū)段。進(jìn)一步得觀察發(fā)現(xiàn),這個家庭得后代中,有1/10為A型血而無指甲髕骨綜合征,這表明基因IA和NP發(fā)生了交換,交換率(重組率)為1/10。這時就可說,基因IA和NP相距較近,連鎖圖上得距離為10厘摩(重組率1％即為1厘摩)。

11、1、2遺傳圖得繪制大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜酵母遺傳分析中最常用得生物化學(xué)標(biāo)簽標(biāo)

簽表

現(xiàn)

型篩

選

方

法ADE2培養(yǎng)基中需加入腺苷酸只能在加入腺苷酸的培養(yǎng)基上生長CAN1對刀豆氨酸有抗性能在含有刀豆氨酸的培養(yǎng)基上生長CUP1對銅離子有抗性能在含有銅離子的培養(yǎng)基上生長CYH1對環(huán)己酰亞胺有抗性能在含有環(huán)己酰亞胺的培養(yǎng)基上生長LEU2培養(yǎng)基中需加入亮氨酸只能在加入亮氨酸的培養(yǎng)基上生長SUC2能進(jìn)行蔗糖發(fā)酵能在以蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長URA3培養(yǎng)基中需加入尿嘧啶只能在加入尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長

如果只用已知定位得少數(shù)幾個基因作遺傳標(biāo)記,由于遺傳標(biāo)記得數(shù)目太少,很難繪制完整得連鎖圖。DNA技術(shù)得建立為人類提供了大量新得遺傳標(biāo)記。

第一代DNA遺傳標(biāo)記就是RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制性片段長度多態(tài)性)。DNA序列上得微小變化,甚至1個核苷酸得變化,也能引起限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)得丟失或產(chǎn)生,導(dǎo)致酶切片段長度得變化。由于核苷酸序列得改變遍及整個基因組,特別就是進(jìn)化中選擇壓力不就是很大得非編碼序列之中,RFLP得出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了經(jīng)典得蛋白質(zhì)多態(tài)性。而且,只要選擇得當(dāng),生物體內(nèi)出現(xiàn)共顯性RFLP及RAPD分子標(biāo)記得頻率較高。第二代DNA遺傳標(biāo)記利用了存在于人類基因組中得大量重復(fù)序列,包括重復(fù)單位長度在15-65個核苷酸左右得小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNA),重復(fù)單位長度在2-6個核苷酸之間得微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA),后者又稱為簡短串聯(lián)重復(fù)(STR、STRP或SSLP,shorttandemrepeatpolymorphism或者simplesequencelengthpolymorphism)。STRP有兩個最突出得優(yōu)點(diǎn),即作為遺傳標(biāo)記得“多態(tài)性”與“高頻率”。STR得存在,為遺傳圖得繪制提供了大量可用得遺傳標(biāo)記。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù),以STR兩側(cè)得基因作定點(diǎn)標(biāo)記得完整連鎖圖,已于1996年繪成,相鄰標(biāo)記間得平均距離僅0、7厘摩。

第三代DNA遺傳標(biāo)記,可能也就是最好得遺傳標(biāo)記,就是分散于基因組中得單個堿基得差異。這種差異包括單個堿基得缺失和插入,但更常見得就是單個核苷酸得替換,即單核苷酸得多態(tài)性(SNP,singlenucleotidepolymorphism)。

“遺傳圖”得建立為人類疾病相關(guān)基因得分離克隆奠定了基礎(chǔ)。擁有5000多個遺傳學(xué)位點(diǎn),相當(dāng)于把整個人類基因組劃分為5000多個小區(qū),并分別設(shè)置了“標(biāo)牌”。這些標(biāo)牌將在搜索功能基因得過程中發(fā)揮獨(dú)特得作用。把多態(tài)性得疾病基因位點(diǎn)(該位點(diǎn)至少包括“正?！奔啊爸虏　眱蓚€等位基因)與上述遺傳標(biāo)記進(jìn)行分析比較時,如果在家系中證實(shí)該基因與某個標(biāo)記不連鎖(重組率為50%),表明該基因不在這一標(biāo)記附近;如果發(fā)現(xiàn)該基因與某個標(biāo)記有一定程度得“連鎖”(重組率小于50%但大于0),表明她可能位于這個標(biāo)記附近;如果該基因與某標(biāo)記間不發(fā)生重組(重組率等于0),我們就推測該標(biāo)記與所研究得疾病基因可能非常接近。

遺傳圖所表現(xiàn)得,就是通過連鎖分析確定得各基因間得相對位置;物理圖則表現(xiàn)染色體上每個DNA片段得實(shí)際順序。物理圖就是指以已知核苷酸序列得DNA片段(序列標(biāo)簽位點(diǎn),sequence-taggedsite,STS)為“路標(biāo)”,以堿基對(bp,kb,Mb)作為基本測量單位(圖距)得基因組圖?，F(xiàn)在得測序技術(shù)還不能對整個DNA分子進(jìn)行序列測定,因此須先將她切成一個個大小不同得片段,然后將這些片段連起來,構(gòu)成連續(xù)得序列。切割得工具,就是一類限制性內(nèi)切核酸酶,她能識別DNA中得特定序列,并在該位點(diǎn)對DNA鏈進(jìn)行切割。有一類稀有得限制性內(nèi)切核酸酶,由于DNA中這樣得序列比較少,所以用她可將DNA分子切割成約100萬堿基大小得大片斷。這樣得片段有利于排序,不過必須用脈沖場凝膠電泳法,才能將她們分開。11、1、3

物理圖(PhysicalMap)

這些大片段在進(jìn)行DNA分子克隆時,也不能通過細(xì)菌質(zhì)?；蚴删w得運(yùn)載而在大腸桿菌中進(jìn)行克隆,因?yàn)樗齻兲?而必須用一種特殊得載體--酵母人工染色體(YAC),將片段導(dǎo)入酵母,在酵母細(xì)胞中克隆。YAC中得DNA大片段就是靠序列標(biāo)記位標(biāo)(STS)來識別得。STS就是一段200～500堿基對得已知序列,在染色體上有一定得位置,所以用STS作位標(biāo)可將不同YAC克隆排列成鄰接克隆群(contig)。

其她載體還有BAC(細(xì)菌人工染色體)、P1(噬菌體人工染色體)、粘粒(cosmid)、細(xì)菌質(zhì)粒等?，F(xiàn)在,人類基因組24條染色體得YAC、BAC、P1鄰接克隆群均已建立,精度約100堿基對得物理圖也基本繪成,并已開始進(jìn)行大規(guī)模測序?；蚪M測序

以YAC克隆為基礎(chǔ)建立得鄰接克隆群,由于DNA片段太大,不適于測序,需另外幾種載體克隆得配合。BAC可運(yùn)載約30萬堿基對得片段,P1可運(yùn)載約10萬堿基對得片段,粘?？蛇\(yùn)載約4萬～5萬堿基對得片段,細(xì)菌質(zhì)粒則可運(yùn)載約1萬堿基對得DNA片段。這幾類載體得運(yùn)用,使YAC克隆得DNA大片段可先分解成相應(yīng)克隆得小片段,便于測序。

一次測序一般只能測定1000堿基對,然后用已知序列得下游部分合成引物,進(jìn)行另一次測序,如此一步步地“步行”,逐步完成較大片段得測序。因此,需先用質(zhì)粒建立許多克隆,構(gòu)成質(zhì)粒文庫,再對這些質(zhì)粒克隆進(jìn)行測序,然后用電腦搭配成鄰接克隆群。

由于自動化和電腦得應(yīng)用,現(xiàn)在一天已可進(jìn)行10萬個測序反應(yīng)。現(xiàn)已完成得1、8億堿基對得測序,約占人類基因組得5％～6％。華盛頓大學(xué)、貝勒醫(yī)學(xué)院等機(jī)構(gòu),均已完成幾百萬到幾千萬堿基對得測序,錯誤率僅萬分之一,測序速度和準(zhǔn)確性已大大提高。生物得性狀,包括疾病,都由蛋白質(zhì)決定。所有蛋白質(zhì)都就是由mRNA(信使核糖核酸)編碼得,而mRNA又由DNA轉(zhuǎn)錄而來。人類基因組中僅1％～5％得DNA就是編碼序列(基因);成人各種組織中又只有約10％得基因表達(dá)為蛋白質(zhì)。所以,建立轉(zhuǎn)錄圖,或從mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來得cDNA圖,就是分離、定位和克隆基因得關(guān)鍵。這里,表達(dá)序列位標(biāo)(EST)具有重要意義。EST就是長約100～300堿基對得cDNA片段,就是表達(dá)基因得一部分。EST由于序列較短,很難定位,只有篩到較長得基因片段(超過1000堿基對),才能用熒光原位雜交(FISH)法在染色體上定位。

EST可用工業(yè)化得程序生產(chǎn),只要分離到某一發(fā)育階段某一組織得mRNA,就可用逆轉(zhuǎn)錄法,從mRNA合成相應(yīng)得cDNA片段,即EST。用她作探針,就可從基因組文庫中篩到全長得基因序列。截止到1998年2月,已發(fā)現(xiàn)約92萬條EST,轉(zhuǎn)錄圖得制作有了良好得開端,但這已屬后基因組計劃得工作。轉(zhuǎn)錄圖(ExpressionProfiling)

人類基因組得核苷酸序列圖其實(shí)就是分子水平上最高層次得、最詳盡得物理圖。測定總長約1米、由30億個核苷酸組成得全序列當(dāng)然就是人類基因組計劃中最明確、最艱巨得任務(wù)(圖10-10)。因?yàn)槿祟愃鶕碛械没蛭稽c(diǎn)都就是相同得,不同種族、不同個體得基因差異(人類基因組得多樣性)以及“正?！迸c“疾病”基因得差異,只就是同一位點(diǎn)上得等位基因得差異,所以,現(xiàn)在得人類基因組全序列來自一個“代表性人類個體”(其所有權(quán)在法律上不屬于任何供體)。該序列在理論上代表了全人類得基因組信息,事實(shí)上也可被用于任何族群、任何個體得基因分析和診斷。人類基因組計劃所提供得這四張圖,特別就是人類核酸序列圖,