AbMoleTET 酶缺失導(dǎo)致小鼠胚胎干細(xì)胞非整倍體的研究

AbMole|TET酶缺失導(dǎo)致小鼠胚胎干細(xì)胞非整倍體的研究來(lái)自拉霍亞免疫學(xué)研究所信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)部的RomainOGeorges,HugoSepulveda,JCarlosAngel等多名研究人員發(fā)表了題為《AcutedeletionofTETenzymesresultsinaneuploidyinmouseembryonicstemcellsthroughdecreasedexpressionofKhdc3》的研究成果。在該文章中，研究人員使用了購(gòu)自AbMole的CHIR-99021·HCl（目錄號(hào)M1989）。急性缺失TET酶會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）出現(xiàn)染色體錯(cuò)分離和非整倍體，這與Khdc3基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，確定了Khdc3等三個(gè)基因在TET缺失的mESC中表達(dá)下調(diào)，且Khdc3基因附近的DNA甲基化增加?；謴?fù)KHDC3水平可防止非整倍體的發(fā)生。這些結(jié)果表明，TET蛋白通過(guò)維持KHDC3的正常表達(dá)來(lái)防止mESC中的有絲分裂異常和維持染色體穩(wěn)定性。TET酶家族的三個(gè)成員（TET1、TET2和TET3）通過(guò)改變基因組中DNA胞嘧啶的修飾狀態(tài)來(lái)影響許多生物學(xué)過(guò)程。在人類和小鼠模型中，TET功能喪失與DNA損傷、基因組不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生有關(guān)。然而，大多數(shù)關(guān)于TET缺陷細(xì)胞中基因組不穩(wěn)定性的研究是在體細(xì)胞或在培養(yǎng)中維持了不同時(shí)間的干細(xì)胞模型上進(jìn)行的，這可能會(huì)掩蓋TET酶直接調(diào)節(jié)的途徑。因此，本研究旨在探討急性、嚴(yán)重的TET功能喪失對(duì)mESC染色體分離和穩(wěn)定性的影響。圖1：三重TET缺陷胚胎和mESC中非整倍體和染色體分離缺陷的出現(xiàn)。條件性刪除TET酶的小鼠胚胎干細(xì)胞系的生成：通過(guò)建立可誘導(dǎo)刪除所有三個(gè)Tet基因的小鼠胚胎干細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)4-羥他莫昔芬（4-OHT）處理可誘導(dǎo)Cre-ERT2融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，驅(qū)動(dòng)loxP位點(diǎn)重組，從而刪除Tet基因。RNA-Seq和qRT-PCR結(jié)果證實(shí)了Tet基因的刪除，Westernblot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明TET1和TET2蛋白表達(dá)消失，5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）水平迅速降低。染色體錯(cuò)分離現(xiàn)象的觀察：通過(guò)實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像觀察到，在4-OHT處理后4天，TetiTKOmESC中染色體錯(cuò)分離（滯后染色體、微核）的發(fā)生率是CtrlmESC的兩倍，這表明TET酶在保護(hù)mESC中染色體準(zhǔn)確分離方面起著直接或間接的作用。非整倍體的檢測(cè)：通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行全基因組測(cè)序和中期染色體鋪展分析，發(fā)現(xiàn)與CtrlmESC相比，TetiTKOmESC中非整倍體核型增加了2-3倍，這表明在TetiTKOmESC中觀察到的染色體錯(cuò)分離導(dǎo)致了單個(gè)TET缺陷細(xì)胞中快速出現(xiàn)非整倍體核型。體內(nèi)胚胎實(shí)驗(yàn)：對(duì)早期（8-細(xì)胞階段）胚胎進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)所有3種TET酶缺失的胚胎細(xì)胞核形態(tài)和大小明顯異質(zhì)，卵裂球數(shù)量、微核和卵裂球碎裂情況可變，這表明染色體錯(cuò)分離可能導(dǎo)致非整倍體。轉(zhuǎn)錄組分析：通過(guò)對(duì)TetiTKOmESC進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)與CtrlmESC相比，TetiTKOmESC中一些與有絲分裂、染色體分離、紡錘體組裝、復(fù)制和/或DNA修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，其中Khdc3下調(diào)最為顯著?；虮磉_(dá)的時(shí)間進(jìn)程分析：Khdc3和Khdc2mRNA在TetiTKOmESC中于4-OHT添加后6.5天下調(diào)，時(shí)間進(jìn)程分析表明，Khdc3mRNA在第3.5天開(kāi)始明顯下降，而Khdc2mRNA在第5.5天開(kāi)始下降不太明顯。與之前發(fā)表的研究結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)只有Khdc3在分析的TetTKOmESC中始終下調(diào)。此外，在長(zhǎng)期缺失Tet的克隆群體中，Khdc3表達(dá)仍然下調(diào)，而Khdc2表達(dá)恢復(fù)正常。這些數(shù)據(jù)表明，Tet缺失對(duì)染色體分離的不利影響可能是由于DNA甲基化增加與Khdc3表達(dá)持續(xù)下調(diào)相關(guān)。圖2：急性Tet1/2/3耗竭誘導(dǎo)許多基因表達(dá)改變，包括編碼SCMC亞基KHDC2和KHDC3的mRNA下調(diào)。DNA甲基化分析：通過(guò)分析已發(fā)表的ChIP-seq、WGBS和RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)DNMTs（特別是DNMT3a）富集在Khdc3轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）的遠(yuǎn)端區(qū)域，而TET1和TET2占據(jù)更接近Khdc2和Khdc3TSS以及基因體的區(qū)域，TetTKOmESC中Khdc3和Khdc2基因及周邊區(qū)域的DNA甲基化增加，Khdc3表達(dá)降低，而DnmtTKO中Khdc3表達(dá)增加。特定DNMT的作用：進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3a是控制Khdc3位點(diǎn)DNA甲基化的最重要的DNMT，并且TET和DNMT蛋白之間存在有趣的相互作用，即雙缺失Dnmt3a和Dnmt3b可防止TetTKOmESC中Khdc3啟動(dòng)子的DNA高甲基化，并且Khdc3表達(dá)恢復(fù)到超過(guò)WT水平。Khdc3在TetiTKOmESC中的重新表達(dá)逆轉(zhuǎn)了非整倍體表型基因編輯和表達(dá)實(shí)驗(yàn)：通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯Khdc2和Khdc3基因，發(fā)現(xiàn)Khdc2或Khdc3缺失會(huì)導(dǎo)致mESC中非整倍體增加。在TetiTKO和CtrlmESC中誘導(dǎo)表達(dá)Khdc2或Khdc3，發(fā)現(xiàn)Khdc3表達(dá)可使TetiTKOmESC中非整倍體的頻率從約60％降至約20％，類似于CtrlmESC中的基礎(chǔ)頻率，而Khdc2表達(dá)則不能逆轉(zhuǎn)TetiTKOmESC中的非整倍體高頻率。這些數(shù)據(jù)表明，TET酶至少部分通過(guò)確保mESC中正常的Khdc3表達(dá)來(lái)控制有絲分裂期間正常的染色體分離。本研究表明，TET蛋白對(duì)確保mESC中染色體分離的保真度很重要，這一作用是通過(guò)下調(diào)Khdc3來(lái)介導(dǎo)的。急性Cre介導(dǎo)的Tet1、Tet2和Tet3基因缺失導(dǎo)致mESC中出現(xiàn)明顯的有絲分裂異常、染色體錯(cuò)分離和非整倍體，這一表型至少部分是由于Khdc3（Filia，Ecat1）的下調(diào)所致，Khdc3編碼一種含KH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，最初被鑒定為母源效應(yīng)基因產(chǎn)物NLRP5（MATER）的相互作用伙伴，是皮層下母體復(fù)合物（SCMC）的核心成分。Khdc3在TetTflmESC中的表達(dá)可防止TetiTKOmESC在4-OHT暴露后快速出現(xiàn)非整倍體，而Khdc2的表達(dá)則沒(méi)有這種作用。此外，研究還討論了Khdc2和Khdc3在維持mESC基因組穩(wěn)定性中的作用。雖然Khdc2和Khdc3mRNA在TetiTKOmESC中均迅速下調(diào)，但Khdc3表達(dá)在長(zhǎng)期培養(yǎng)后仍下調(diào)，而Khdc2表達(dá)恢復(fù)。這表明Khdc3可能獨(dú)立于Khdc2來(lái)防止TetiTKOmESC中的染色體不穩(wěn)定；或者，因?yàn)镵hdc2mRNA在對(duì)照mESC中表達(dá)水平高于Khdc3mRNA，并且在急性缺失或長(zhǎng)期培養(yǎng)的TetiTKOmESC中下調(diào)不明顯，所以這兩種蛋白質(zhì)可能作為一個(gè)復(fù)合物發(fā)揮作用，其中KHDC3蛋白是限制性的，而KHDC2蛋白不是。最后，研究指出DNA甲