羊副流感3型診斷技術(shù)規(guī)范

1羊副流感3型診斷技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了綿羊、山羊副流感3型的臨床癥狀、病原分離、RT-PCR、ELISA方法的實驗室診斷技術(shù)要求。本文件適用羊飼養(yǎng)場（戶）和動物疫病診療單位對羊副流感3型病毒的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款，其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語與定義下列術(shù)語與定義適用于本文件。3.1羊副流感病毒3型CaprineParainfluenzavirustype3，CPIV3屬于副黏病毒科，呼吸道病毒屬成員，為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。該病毒可引起以羊發(fā)熱、呼吸困難、流漿液性或黏膿性鼻液和咳嗽等呼吸道癥狀為特征的疾病。4縮略語下列縮略語適用于本文件。RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）TAE緩沖液：是由三羥甲基氨基甲烷(TrisBase)、乙酸(AceticAcid)和乙二胺四乙酸(EDTA)組成的緩沖液FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSolution）5臨床癥狀病羊主要臨床癥狀包括：流清亮或黏膿性鼻液、咳嗽氣喘、體溫升高到40℃以上、精神沉郁、食欲減退、部分羊可見流淚、結(jié)膜炎、流涎、有時出現(xiàn)腹瀉。6實驗室診斷26.1病毒分離方法6.1.1材料棉簽、FBS、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（板）。6.1.2儀器電子天平、研磨儀、低溫高速離心機、生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、冰箱。6.1.3細(xì)胞牛腎細(xì)胞（MDBK）。6.1.4病料采集6.1.4.1呼吸道拭子用無菌棉簽采取鼻道分泌物，然后放入含1000IU/ml青霉素1000μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的凍存管中，編號，記錄，2℃~8℃條件下，盡快送往實驗室。6.1.4.2糞便拭子用無菌棉簽插入肛門取樣或用棉簽采集新鮮糞便，然后放入含1000IU/ml青霉素1000μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，編號，記錄，2℃~8℃條件下盡快送往實驗室。6.1.4.3血清樣品用促凝管采集新鮮血液，靜置分離血清，編號，記錄，2℃~8℃條件下盡快送往實驗室。6.1.4.4組織樣品剛死亡的羊，采集肺組織樣品，放入離心管，編號，記錄，2℃~8℃條件下盡快送往實驗室。6.1.5樣品處理6.1.5.1先經(jīng)凍融兩次，擰干棉拭子，將樣品液經(jīng)6000r/min離心10min，使用一次性注射器吸取上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?.1.5.2血清將促凝管中靜置分層的血清轉(zhuǎn)移到滅菌離心管，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?.1.5.3組織按體積比1:3～1:5加入PBS（pH7.2～7.4），使用組織研磨儀制成勻漿液，取懸液經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?.1.6樣品接種取處理過的樣品200μl（樣品接種量根據(jù)細(xì)胞數(shù)目調(diào)整）接種到長滿80%的MDBK細(xì)胞（25㎝2培養(yǎng)瓶），37℃吸附30min；加入含2%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液5ml，同時設(shè)對照組，置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱。6.1.7結(jié)果判定逐日觀察細(xì)胞病變，培養(yǎng)5日后凍融兩次，繼續(xù)盲傳，觀察細(xì)胞病變。CPIV3致細(xì)胞病變特點：細(xì)胞變圓、大量脫落、貼壁細(xì)胞變長聚集形成網(wǎng)狀。盲傳三代后，若出現(xiàn)病變則收獲培養(yǎng)物，經(jīng)反復(fù)凍融，以3000r/min離心10min，去除細(xì)胞碎片并取上清液進一步鑒定。6.2RT-PCR6.2.1材料3移液器及吸頭、無菌無酶離心管、PCR管、病毒RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、TAE緩沖液、瓊脂糖、核酸染料、引物（附錄A）6.2.2儀器PCR儀、臺式冷凍離心機、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像儀。6.2.3待檢樣品處理后的樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物。6.2.4病毒RNA提取使用病毒RNA提取試劑盒對已處理的待檢樣品、陰性對照樣品、陽性對照樣品進行RNA提取并使用核酸分析儀對RNA質(zhì)量及濃度進行測定。6.2.5RT-PCR反應(yīng)體系6.2.5.1RT反應(yīng)65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻。在上述Microtube管加5×PrimeScriptIIBuffer4μl，RNase4.5μl，緩慢混勻。反應(yīng)條件42℃45min，95℃5min后，冰上冷卻。6.2.5.2PCR反應(yīng)25μl體系：Premix溶液12.5μl，上下游引物（見附錄A）各0.5μl，cDNA模板2μl，無菌無酶水9.5μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min,95℃30s，50℃30s，72℃60s，進行35個循環(huán)，72℃延伸10min。6.2.6結(jié)果判定取PCR產(chǎn)物10μl，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓100V，時間30min，電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。當(dāng)陽性對照樣品出現(xiàn)400bp擴增帶、陰性對照樣品無擴增帶出現(xiàn)時，試驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴增帶為羊副流感病毒陽性，否則為陰性。6.3間接ELISA抗體檢測6.3.1材料CPIV3重組N蛋白、陰性血清對照、陽性血清對照、辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊二抗、抗原包被緩沖液（見附錄B.1）、洗滌液（見附錄B.2）、封閉液（見附錄B.3）、TMB底物顯色試劑盒和終止液（見附錄B.4）。6.3.2儀器設(shè)備酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀、移液器及吸頭。6.3.3操作方法6.3.3.1抗原包被4將CPIV3重組N蛋白用包被緩沖液稀釋至終濃度為0.05μg/mL，每孔100μL包被96孔酶標(biāo)板，4℃包被16h。用洗滌緩沖液洗板5次，每孔200μl，每次3min，洗滌結(jié)束后拍干。200μl/孔加入封閉緩沖液，37℃封閉1.5h，用洗滌緩沖液洗板5次后拍干。6.3.3.2洗板甩掉孔內(nèi)的包被液，洗滌液（200μl/孔），洗滌三次。6.3.3.3封閉每孔加封閉液（200μl/孔），置37℃封閉1h,洗滌三次。6.3.3.4加樣酶標(biāo)板上對照和樣品的分布圖，見圖1。在A1孔和B1孔加入CPIV3陽性對照血清各100μl，在C1孔和D1孔加入CPIV3陰性對照血清各100μl；剩余孔加入待檢樣品血清100μl，每孔兩個平行，37℃孵育0.5h，洗板同上。123456789APBPCNDNEFGH圖1樣品加樣記錄表（推薦模式）說明：P—陽性血清對照孔；N—陰性血清對照孔；S1、S2、S3、S4等—待檢血清孔，以此類推。6.3.3.5加酶標(biāo)記抗體每孔加入用封閉液稀釋至工作濃度的酶標(biāo)記抗體100μl，置37℃再孵育1h，洗滌三次。6.3.3.6加底物溶液加入顯色底物(TMB)溶液100μl/孔，置37℃避光反應(yīng)15min。6.3.3.7終止反應(yīng)加入終止液50μl/孔,混勻后即刻測量OD450值。6.3.4結(jié)果判定6.3.4.1P/N比法被檢樣品(P)的吸光度值和陰性標(biāo)準(zhǔn)樣品(N)值之比。52.0>P/N>1.50P/N>2.06.3.4.2目視比色法判為陰性判為可疑判為陽性被檢血清孔近于或淺于標(biāo)準(zhǔn)陰性血清孔者判為陰性；略深于標(biāo)準(zhǔn)陰性血清孔者判為可疑；明顯深于標(biāo)準(zhǔn)陰性血清孔者判為陽性。7綜合判定7.1經(jīng)5判定為疑似CPIV3感染病例，經(jīng)病毒分離培養(yǎng)和PCR方法檢測出CPIV3，可判為羊副流感3型病毒感染。7.2臨床無明顯特異癥狀的非免疫動物經(jīng)間接ELISA方法檢測出抗體陽性，可判為該動物曾感染或已感染羊副流感3型病毒，需結(jié)合其他方法進行綜合確診。6（資料性）A.1引物序列產(chǎn)物大小上游引物CATTGAATTCATACTCAGCAC400bp下游引物AGATTGTCGCATTT(AG)CCTCA.2引物溶解上下游引物用無菌的DEPC處理水配制成10μmol/l。（資料性）試劑的配制B.1抗原包被緩沖液（0.05mol/lpH9.6碳酸鹽緩沖液）碳酸鈉碳酸氫鈉去離子水0.318g0