《柑橘衰退病毒基因型鑒定技術(shù)規(guī)程》編制說明

2/4《柑橘衰退病毒基因型鑒定技術(shù)規(guī)程》地方標(biāo)準(zhǔn)（草案）編制說明一、編制本標(biāo)準(zhǔn)的任務(wù)來源江西省是我國重要的柑橘產(chǎn)區(qū)，有著贛南臍橙、南豐蜜橘、井岡蜜柚等眾多特色柑橘品種，種植規(guī)模宏大，但這些柑橘產(chǎn)區(qū)均受到柑橘衰退病毒（Citrustristezavirus，CTV）不同程度的危害且有加劇趨勢，嚴(yán)重影響我省柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。根據(jù)國家臍橙工程技術(shù)研究中心近年來對全國柑橘主產(chǎn)區(qū)的隨機(jī)采樣檢測，發(fā)現(xiàn)CTV的平均檢出率為51.75%，表明CTV在我國柑橘主產(chǎn)區(qū)分布極為普遍，田間CTV以VT、RB、T3、T30、T36、T68等不同基因型的代表分離物構(gòu)成為主，且以多基因型混合侵染，不同基因型引起不同的病害癥狀，如VT引起莖陷點(diǎn)型，T36引起苗黃型癥狀。CTV是一種RNA病毒，存在復(fù)雜的株系分化，田間主要通過接穗和蚜蟲進(jìn)行傳播，當(dāng)前大田柑橘衰退病最有效和可行的保護(hù)措施是弱毒株系交叉保護(hù)技術(shù)，由于柑橘植株感染CTV并不是單一基因型，一般以2種或2種以上基因型混合侵染，因此急需建立CTV基因型鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，針對性的開展CTV基因型檢測鑒定，明確田間CTV基因型類型及分離物構(gòu)成情況，篩選具有針對特定基因型的弱毒株系和開展交叉保護(hù)技術(shù)應(yīng)用，為生產(chǎn)上柑橘衰退病的防控提供技術(shù)支持。為了規(guī)范柑橘衰退病毒基因型鑒定技術(shù)，按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》有關(guān)規(guī)定，由江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出，國家臍橙工程技術(shù)研究中心制訂了本規(guī)程。本規(guī)程的鑒定技術(shù)經(jīng)國家臍橙工程技術(shù)研究中心在江西多地柑橘產(chǎn)區(qū)果園反復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為生產(chǎn)上高效準(zhǔn)確鑒定CTV基因型，明確病原與病害關(guān)系和病害防控提供了技術(shù)支持。2023年6月由江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出立項(xiàng)建議。二、標(biāo)準(zhǔn)編制概況（一）基本情況1.本標(biāo)準(zhǔn)由江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。2.本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：贛南師范大學(xué)國家臍橙工程技術(shù)研究中心。3.本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：易龍、李雙花、周俊、姚鋒先、黃愛軍、余海中。4.本標(biāo)準(zhǔn)編寫格式依據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》。（二）標(biāo)準(zhǔn)的編制過程《柑橘衰退病毒基因型鑒定技術(shù)規(guī)程》地方標(biāo)準(zhǔn)的制定過程經(jīng)歷了以下階段：2022年7月至2023年5月，成立標(biāo)準(zhǔn)工作小組，編制工作計(jì)劃，開展標(biāo)準(zhǔn)起草工作，通過實(shí)地調(diào)研、資料收集、起草小組多次討論研究，形成了標(biāo)準(zhǔn)草稿，并申請立項(xiàng)；2023年6月5日，江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出立項(xiàng)建議；2023年7月31日，標(biāo)準(zhǔn)工作小組參與了該標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)答辯工作；2023年8月至2023年10月，開展進(jìn)一步試驗(yàn)研究，完成標(biāo)準(zhǔn)討論稿后，在標(biāo)準(zhǔn)工作小組內(nèi)部進(jìn)行討論修改形成標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿；2023年10月-11月，征求意見，標(biāo)準(zhǔn)工作小組根據(jù)意見和建議修改完善標(biāo)準(zhǔn)。（三）主要技術(shù)依據(jù)說明柑橘衰退病毒基因型鑒定技術(shù)目前尚無相應(yīng)的國家、地方標(biāo)準(zhǔn)或技術(shù)規(guī)程對CTV基因型鑒定技術(shù)進(jìn)行規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)引用了柑橘苗木產(chǎn)地檢疫規(guī)程（GB5040），規(guī)范了田間實(shí)地取樣的要求。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范了樣本RNA的提取方法、RT-PCR檢測技術(shù)體系及基因型判定方法，鑒定結(jié)果中對照出現(xiàn)一條大小為771bp的特異性條帶，陰性對照沒有任何擴(kuò)增條帶，待檢樣品若出現(xiàn)與陽性對照相同大小的771bp特異性條帶，則判定該樣品為陽性，若未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶，則判定樣品為陰性。將攜帶CTV的樣品核酸經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)電泳于凝膠成像系統(tǒng)觀察，陰性對照無擴(kuò)增條帶，陽性對照出現(xiàn)583bp（VT）、316bp（RB）、417bp（T3）、590bp（T30）、175bp（T36）、491bp（T68）特異性條帶，對樣本進(jìn)行基因型分類判定。三、標(biāo)準(zhǔn)的編制原則1.原則性本著科學(xué)、合理、客觀、高效，符合實(shí)際工作需要，易于規(guī)范和推廣柑橘衰退病毒基因型鑒定技術(shù)的基本原則。標(biāo)準(zhǔn)的制定格式嚴(yán)格按照GB/T1.1《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)與編寫規(guī)則》的規(guī)定編寫。2.適應(yīng)性標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容包括柑橘衰退病毒基因型鑒定術(shù)語和定義,適用于柑橘類植物感染柑橘衰退病毒的RT-PCR檢測和基因型鑒定。根據(jù)柑橘衰退病的田間癥狀調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室RT-PCR檢測技術(shù)要求，規(guī)定了柑橘衰退病的田間癥狀識別特征、室內(nèi)檢測儀器、試劑、樣品預(yù)處理要求，樣品RNA提取、RT-PCR檢測技術(shù)體系及基因型鑒定方法等內(nèi)容。3.參考國際慣例，結(jié)合我國實(shí)際目前尚無相應(yīng)的國家、地方標(biāo)準(zhǔn)或技術(shù)規(guī)程對CTV基因型鑒定技術(shù)進(jìn)行規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)充分參考國際國內(nèi)柑橘衰退病毒基因型鑒定技術(shù)及存在的具體問題，結(jié)合我國相關(guān)的法律法規(guī)、技術(shù)規(guī)范，制定本標(biāo)準(zhǔn)。四、與現(xiàn)行的法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)符合我國目前法律、法規(guī)的規(guī)定，本標(biāo)準(zhǔn)與其它相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)沒有矛盾之處。五、重大分歧意