支原體怎么檢測？這些方法你得知道

支原體（Mycoplasma）別名霉形體，直徑只有100-200nm，正好可以穿過0.22um濾膜，逃過光學(xué)顯微鏡分辨率的極限，我們看不到它，也過濾不了它，可謂狡猾至極。若放任支原體肆意繁殖，它會通過氣溶膠傳播，甚至污染整個細(xì)胞房里所有的細(xì)胞，嚴(yán)重影響實驗研究。毫不夸張地說，支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最令人頭疼的麻煩之一。因此，及時發(fā)現(xiàn)并清除支原體污染對于維護細(xì)胞地健康狀態(tài)至關(guān)重要。本文中，小尚將介紹幾種非常方便的支原體檢測方法，幫助科研人員更好地應(yīng)對這一問題。常規(guī)PCR法支原體16SrRNA、16S-23SrRNA、23SrRNA是進(jìn)化上較為保守的大分子,據(jù)此設(shè)計特異性引物。取培養(yǎng)細(xì)胞3-5天的上清作為模板，使用PCR的方法擴增后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用成像儀觀察是否有支原體基因擴增條帶。目前已有許多文獻(xiàn)公開不同種類支原體引物序列。優(yōu)點：靈敏度高、特異性高、檢測周期較短缺點：對儀器要求高（需要準(zhǔn)備PCR儀，電泳儀、成像儀等設(shè)備）、操作較復(fù)雜▲

常規(guī)PCR檢測結(jié)果[1]巢式PCR法設(shè)計兩對引物（外圍引物與內(nèi)圍引物），取培養(yǎng)細(xì)胞3-5天的上清作為模板，進(jìn)行兩次PCR擴增反應(yīng)。第一次PCR用外圍引物的將支原體保守區(qū)DNA進(jìn)行大量擴增，以內(nèi)圍引物對第一次PCR產(chǎn)物其進(jìn)行第二次擴增。此方法極大地提高了靈敏度和特異性，可檢測微量污染。PCR產(chǎn)物測序后可確定支原體類型。

優(yōu)點：靈敏度很高、特異性很高、檢測周期較短缺點：對儀器要求高（需要準(zhǔn)備PCR儀，電泳儀、成像儀等設(shè)備）、操作較復(fù)雜▲

巢式PCR檢測結(jié)果[2]環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（LAMP法/顯色法/一步法）DNA在65℃條件下處于一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，而BstDNA聚合酶可在等溫條件下擴增DNA模板。因此使用數(shù)對引物及BstDNA聚合酶，在65℃條件下進(jìn)行等溫環(huán)介導(dǎo)擴增，可將微量的支原體DNA擴增上億倍。與PCR相比，不需要模板熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，用一個簡單地恒溫裝置就可以完成檢測，而且特異性和靈敏度并不遜色于PCR法。優(yōu)點：在恒溫條件下實驗，直接觀察顏色判斷，對操作和設(shè)備要求低缺點：當(dāng)污染為弱陽性的時候，顏色的變化可能不明顯，容易造成錯誤的結(jié)果解讀▲

LAMP法檢測結(jié)果化學(xué)發(fā)光法（酶法）通過裂解支原體，釋放特有酶催化合成ATP，產(chǎn)生的ATP與試劑中的熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，通過比較反應(yīng)前后熒光量變化確定樣品中是否含有支原體污染。該方法可以有效、快速、靈敏的檢測支原體污染，只需要少量樣品即可檢測支原體污染情況。優(yōu)點：快速、簡便缺點：對儀器要求高，化學(xué)發(fā)光儀或可以檢測化學(xué)發(fā)光的酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光專用96孔板▲

酶法檢測結(jié)果[3]DNA熒光染色法使用DNA熒光染料（如Hoechst33258、DAPI等）對細(xì)胞進(jìn)行染色，無污染細(xì)胞只有細(xì)胞核著色，而受污染細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞周圍會出現(xiàn)大小、形態(tài)不規(guī)則的熒光著色。優(yōu)點：操作簡便，成本低，快速，直觀缺點：靈敏度低，難以判斷輕度污染，可作為初步篩查手段，需結(jié)合其他方法檢測▲

DAPI染色檢測結(jié)果[1]支原體檢測方法有很多種，除了上述幾種方法，還有培養(yǎng)法、電鏡觀察法、ELISA法等，每種方法各有利弊，科研人員應(yīng)根據(jù)實驗需求和實際情況選擇合適的檢測方法。使用兩種或兩種以上的方法進(jìn)行檢測，結(jié)果可信度更高。同時，定期對細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測也很重要哦！參考文獻(xiàn)：[1]桂馨,錢潔,許潔,等.細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體污染的檢測及預(yù)防[J].同濟大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2013,34(03):24-27.[2]黃海軍,高其雙,彭霞,等.細(xì)胞支原體巢式PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,53(03):690-693.DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2014.03.049.[3]盧勇,