《淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增檢測方法》編制說明（征求意見稿）

《食用玉米淀粉》和GB/T25219-201法》；木薯淀粉的GB2713-2015《淀本標(biāo)準(zhǔn)的制定參考了GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化本文件規(guī)定了淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分的梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增檢測方法。本文件適用于淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分的定性檢測。本文件所規(guī)定方法的檢出限（LOD）為1%（質(zhì)量比）。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T12104淀粉術(shù)語GB/T27403-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測3術(shù)語和定義GB/T12104界定的術(shù)語和定義適用于本文件。4方法提要提取樣品DNA，用已知含玉米、木薯成分的樣品DNA作陽性對照，用已知不含玉米、木薯成分的樣品DNA作陰性對照，滅菌雙蒸水作為空白對照，使用特異性引物和探針，采用梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增技術(shù)，根據(jù)熒光信號和擴(kuò)增現(xiàn)象，判定是否存在玉米、木薯源性成分。5原理選擇Tm值曲線為梯型（包括人字梯型、半人字梯型和直梯型）的特異性核酸片段為靶序列設(shè)計巢式引物，將巢式引物的外引物與內(nèi)引物分別連接成一對引物作為等溫擴(kuò)增用引物，借助外引物與核酸靶序列上對應(yīng)片段的熔解溫度差異提供單鏈模板，在DNA聚合酶（大片段）催化下通過合成反應(yīng)與鏈替代反應(yīng)對梯型Tm值曲線的靶標(biāo)核酸片段進(jìn)行等溫擴(kuò)增，進(jìn)行不同淀粉成分的定性分析。6試劑或材料除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。6.1植物基因組DNA提取試劑盒。6.2梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增檢測LMTIA試劑盒。Proofman探針法6.3梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增檢測LMTIA的引物和探針。玉米、木薯引物和探針詳見表1。玉米和木薯引物擴(kuò)增的靶標(biāo)序列參見附錄A。6.4梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增檢測反應(yīng)混合液（5μL（2X）通用型LMTIA預(yù)混液，0.4μL(100U/μL)(U，Unit，酶學(xué)單位)Bst酶）。表1玉米、木薯成分鑒定用引物和探針序列名稱序列(5’→3’)靶基因玉米正向引物F:ACCTGGGGTCGCGGTTTTTATTCGGCCCTAAGGACCCATITS反向引物B:CCCCAGGTCAGTCGGGTTTTATATGCTTAAACTCAGCGGG環(huán)引物L(fēng)F:GGCAAGCTCGGTCGCT探針:BHQ1-GGCAAGCTCGGTCGCC-FAM木薯正向引物F:GCCCACGGCCGTTTTCACGGCTATCGGTGGTTGITS反向引物B:CGGCCGTGGGCTTTTCCCGTTCGGCAGACGTTC環(huán)引物L(fēng)F:TGTCCGAGGGTCTTC探針:BHQ1-TGTCCGAGGGTCTTT-ROX7儀器設(shè)備7.1等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀。7.2恒溫水浴鍋。7.3離心機(jī)：離心力≥12000g。7.5恒溫混勻儀。7.6渦旋震蕩器。7.7pH計，精度為0.01。7.8天平：感量0.01g。7.9微量紫外-可見分光光度計。8檢測步驟8.1DNA提取采用市售的植物基因組DNA提取試劑盒提取。將樣品研磨至粉末（淀粉樣品直接稱取取100mg~200mg于2mL離心管中，詳見試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)DNA的提取。注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用雙蒸水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃,以防DNA降解。8.2DNA濃度與純度的檢測使用核酸蛋白儀或微量紫外-可見分光光度計檢測提取DNA的濃度與純度。分別檢測260nm和280nm處的吸光值，每個樣品重復(fù)測三次，取平均值。當(dāng)A260/A280比值在1.6～2.0時，可用于LMTIA擴(kuò)增。8.3梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增8.3.1梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系見表2。PCR八聯(lián)管中按表1依次加入反應(yīng)試劑，混勻。放入等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀。表2梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系（10μL）試劑體積(μL）梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增反應(yīng)混合液5.4正向引物F（100μmol/L）0.16反向引物B（100μmol/L）0.16環(huán)引物L(fēng)F（100μmol/L）0.04探針（10μmol/L）0.1滅菌雙蒸水DNA模板2.08.3.2梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增反應(yīng)程序按照表2配制玉米、木薯基因的反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋旱葴責(zé)晒鈹U(kuò)增儀，玉米和木薯的檢測溫度分別設(shè)置為61℃和62℃,設(shè)置40個循環(huán)，每個循環(huán)30s。在樣品等溫擴(kuò)增的同時，檢測過程中應(yīng)分別設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照。用已知含玉米、木薯成分的樣品DNA作陽性對照，用已知不含玉米、木薯成分的樣品DNA作陰性對照，和空白對照（滅菌雙蒸水），實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。9結(jié)果判定若有FAM熒光檢出，等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢的曲線，則判定樣品含有玉米源性成分，表述為“檢出玉米成分”;S曲線參考附錄B；若有ROX熒光檢出，等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢的曲線，則判定樣品含有木薯源性成分，表述為“檢出木薯成分”;S曲線參考附錄B；如無FAM熒光檢出，無S典型擴(kuò)增曲線，則判定為不含玉米源性成分，表述為“未檢出玉米成分”;如無ROX熒光檢出，無S典型擴(kuò)增曲線，則判定為不含木薯源性成分，表述為“未檢出木薯成分”;在樣品梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增的同時，應(yīng)設(shè)置梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增陰性對照、梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增陽性對照和梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增空白對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。管理委員會頒發(fā)的玉米淀粉的GB1353-2018《玉米》、GB/T10463-2008《玉標(biāo)準(zhǔn)GB/T29343-2012bz《國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的BJS201707《植物蛋