AbMole熒光染料的詳細(xì)講解

AbMole|關(guān)于熒光染料的詳細(xì)講解在這個充滿探索與發(fā)現(xiàn)的科研時代，每一個細(xì)微的細(xì)胞活動都蘊藏著生命的奧秘，熒光染料可以標(biāo)記微觀世界中的精細(xì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物大小分子，使生命科學(xué)研究變得絢爛多彩，為我們開啟了探索之門。AbMole為您介紹熒光染料的發(fā)光原理、主要種類和一些熱門染料的應(yīng)用。熒光染料的發(fā)光原理圖1熒光染料的發(fā)光原理熒光染料是指吸收某一波長的光波后能發(fā)射出另一波長大于吸收光光波的物質(zhì)，它們一般含有若干個芳香族基團(tuán)，這些基團(tuán)具有較強的光吸收能力，在吸收激發(fā)光能量后，染料分子的內(nèi)部能量狀態(tài)顯著提升，躍遷至一個不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)（S1’）。由于激發(fā)態(tài)具有較高的能量水平，它傾向于尋求向更穩(wěn)定的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。一般有機(jī)分子會通過化學(xué)鍵的旋轉(zhuǎn)或振動等機(jī)械運動來逐步釋放能量，但經(jīng)過設(shè)計的熒光分子會先通過震動進(jìn)入S1狀態(tài)隨后直接以光子的形式釋放剩余的能量，即發(fā)出熒光。熒光分子的主要種類熒光分子主要有香豆素類、花菁類染料、BODIPY類、熒光素和羅丹明類等幾種類型。香豆素?zé)晒馊玖戏肿恿亢苄。勺贤饧ぐl(fā)，一般發(fā)藍(lán)色熒光，常常作為多色熒光檢測實驗中的藍(lán)光染料。花菁染料(Cyanine，簡寫Cy)是另一類常見的熒光染料，例如Cy3。花菁的核心結(jié)構(gòu)是兩個含氮雜環(huán)通過奇數(shù)的次甲基連接形成，每增加一個乙烯基團(tuán)，會使得光譜紅移約100nm。熒光素和羅丹明都屬于氧雜蒽染料，它們具有極高的亮度，并且其激發(fā)和發(fā)射波長都位于可見光譜范圍內(nèi)，但是熒光素的pKa值為6.4，因此其光譜特性在很大程度上受環(huán)境pH值的影響，這一類熒光分子種類較多，最常見的包括異硫氰酸熒光素（FITC）、羧基熒光素、羅丹明，羅丹明6G、110、123等。二吡咯烷硼化合物，又名BODIPY，因其卓越的光物理特性而備受歡迎。它們具有高量子產(chǎn)率、出色的亮度、窄半峰寬的吸收和發(fā)射光譜等優(yōu)點。BODIPY的各種衍生物覆蓋了從綠色（BODIPYFL）到紅色（BODIPY650/665）的大部分可見光譜范圍，基于BODIPY的熒光探針目前廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域。圖2常見熒光染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)科研常用熒光染料熒光染料在生命科學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中起到了重要的作用，它們可以染色細(xì)胞核、細(xì)胞膜和膜性結(jié)構(gòu)、線粒體、溶酶體等，也可以對細(xì)胞的狀態(tài)例如凋亡、活死等進(jìn)行染色以便于大家分析，下面簡單介紹一些科研中常用的熒光染料。細(xì)胞核染色細(xì)胞核染料主要有DAPI和Hoechst系列產(chǎn)品。DAPI的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為350和460nm，發(fā)藍(lán)色熒光。DAPI無法活染，一般DAPI染色前需要對細(xì)胞進(jìn)行多聚甲醛的固定。Hoechst則可以對活細(xì)胞進(jìn)行染色，一般在延時成像等持續(xù)性的熒光觀察實驗中會用到該產(chǎn)品，其最大激發(fā)和發(fā)射波長與DAPI相接近。圖3Hoechst33342染色效果圖細(xì)胞線粒體染色和線粒體膜電位檢測MitoTracker系列染料可以選擇性地積聚在線粒體基質(zhì)中，通過與半胱氨酸殘基的游離硫醇基反應(yīng)來共價結(jié)合線粒體蛋白，從而可以對線粒體進(jìn)行染色。線粒體膜電位對于細(xì)胞的正常能量代謝和功能維持至關(guān)重要，JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1則不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光，通過流式細(xì)胞術(shù)、激光掃描共聚焦顯微鏡等即可對細(xì)胞的膜電位進(jìn)行量化或者定性分析。圖4JC-1染色效果圖活死細(xì)胞染色試劑盒：CalceinAM/PI當(dāng)需要對細(xì)胞的存活和死亡進(jìn)行分析時，可以使用CalceinAM/PI雙重染色法。Calcein-AM可透過細(xì)胞膜但其自身并不是熒光分子，通過活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用，Calcein-AM能脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein能發(fā)出強綠色熒光

(激發(fā):490nm，發(fā)射:515nm)。因此Calcein-AM僅對活細(xì)胞染色；而PI無法染色活細(xì)胞，只能穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光

(激發(fā):535nm，發(fā)射:617nm)。通過上述兩種熒光染料的雙重染色即可分辨出細(xì)胞群體中死亡和存活的細(xì)胞。圖5活死細(xì)胞染色效果圖凋亡檢測試劑盒：AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞在凋亡的早期會發(fā)生磷脂酰絲氨酸（PS）的外翻，而AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，與PS有高度親和力，利用FITC標(biāo)記AnnexinV孵育細(xì)胞即可以檢測出早期凋亡的細(xì)胞，而用PI則可以檢測出已經(jīng)死亡的細(xì)胞。通常該試劑盒被用于凋亡細(xì)胞的流式定量。圖6AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測活性氧探針DCFH-DA活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）是機(jī)體進(jìn)行正常有氧代謝的產(chǎn)物，含氧并且性質(zhì)活潑的一類物質(zhì)的總稱。包含超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH-）、臭氧（O3）和單線態(tài)氧（1O2）等，由于它們含有不成對的電子，因此具有很高的化學(xué)反應(yīng)活性。DCFH-DA具有較強的非極性可以自由進(jìn)出細(xì)胞膜，但當(dāng)它被胞內(nèi)的酯酶水解后則無法透過細(xì)胞膜，并且在被ROS氧化成DCF后具有熒光發(fā)光的能力。圖7DCFH-DA檢測ROS脂質(zhì)過氧化物探針BODIPYC11581/591可用于檢測細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化情況。該染料可以插入細(xì)胞膜中，如果在細(xì)胞膜中發(fā)生氧化，則該染