分子生物學研究技術

Module1:分子生物學研究技術cDNA文庫cDNA文庫，代表了生物體某一器官或組織mRNA中所有的或絕大部分的遺傳信息。其構建過程總共有5個步驟（5項技術）：1、總RNA的提?。?、mRNA的純化；3、cDNA的合成；4、cDNA文庫構建；5、基因文庫篩選。詳細：1、總RNA的提?。耗壳俺Ｓ玫奶崛》椒ㄊ钱惲蚯杷犭?苯酚提取法（Trizol提取法），提取步驟：（1）首先用液氮研磨材料成勻漿，加入Trizol試劑，進一步破碎并溶解細胞；（2）加入氯仿抽提，離心，收集含有RNA的水相；（3）用異丙醇沉淀，初步純化RNA，獲得樣品用于下一步mRNA的純化；（PS：實驗中還常將含有RNA的細胞破碎物液通過硅膠膜純化柱后，再通過低鹽濃度下從硅膠膜上直接洗脫RNA，獲得純度較高的總RNA）；總RNA的濃度、純度測定：通過分光光度計測其OD260和OD280值，OD260為1時相當于RNA總量為40μg/ml；而OD260/OD280的比值如果在1.8~2.0之間，則表示所提取的RNA純度較好。 2、mRNA的純化：純化原理，將真核細胞的mRNA分子具有5‘端帽子（m7G）和3’端poly（A）尾巴的特征結構，作為提取時的選擇性標記。純化提取方法：常用寡-纖維素柱層析法獲，該方法利用mRNA3‘末端的poly（A）尾巴的特點，當RNA流經寡-纖維柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA或特異性結合到柱子上，之后再用低鹽溶液洗脫mRNA，經過兩次層析后可獲得較高純度的mRNA。 3、cDNA的合成：利用RT-PCR技術，常以oligo（dT）為引物，甲基化的dCTP（保證新合成的cDNA鏈被甲基化，防止構架克隆時被限制性內切酶切割）。合成基本過程：以mRNA為模板鏈，在逆轉錄酶的催化下以甲基化dCTP為原料合成第一條cDNA鏈；之后再以第一條cDNA鏈為模板，在DNA聚合酶催化下合成第二條cDNA（常用RNaseH切割mRNA-cDNA雜鏈中的mRNA序列所產生的小片段為引物合成的第二條cDNA片段，再同過連接酶的作用連接成完整的DNA鏈。（PS：最后，cDNA兩端應加上不同內切酶所識別的接頭序列，保證所獲得的cDNA具有方向性） 4、cDNA文庫的構建：由于cDNA的長度一般為0.5~8Kb，所以常用質粒載體和噬菌體類的載體便能用于承載cDNA。基本過程：將合成的cDNA連接到特定的載體上，然后將載體轉入宿主細胞（一般為大腸桿菌），然后篩選陽性克隆，最終獲得cDNA文庫。PS：一般而言，cDNA文庫的載體選擇要根據文庫的用途來確定，例如Uni-zapXR載體是一種噬菌粒載體，具備噬菌體的高效性和質粒載體系統(tǒng)可利用藍白斑篩選的便利，可容納0~10kbDNA片段插入。 5、基因文庫篩選：是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需要的重組DNA分子的特定克隆的過程。目前主要的篩選方法有：核酸雜交法、PCR篩選法和免疫篩選法。核酸雜交法（最常用的篩選方法之一）：（1）將圓形硝酸纖維素膜放在含有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿表面，將待篩選的菌落從其生長的平板上轉移到硝酸纖維素膜上，后進行適當?shù)臏赜ㄍ瑫r保留原菌板作為對照。）（2）取出已長有菌落的硝酸纖維素膜，用堿液處理，裂解細菌并使DNA變性；（3）接著用蛋白酶K處理硝酸纖維素膜上的蛋白質，形成菌落DNA印跡；（4）80℃烘烤濾膜，將DNA固定在膜上；（5）將濾膜與放射性同位素標記的DNA或RNA探針雜交，通過放射自顯影顯示雜交結果。（X射線底片上顯黑色斑點的就是試驗中尋找的目的克?。?）通過比對顯影的結果，可在對應的原菌板上獲得相對應的克隆。PCR篩選法：使用前提，已知足夠的序列信息并獲得基因特異性引物。基本過程：（a）將整個文庫（以質粒或菌落的形式均可）保存到多孔培養(yǎng)板上；（b）用設計好的目的基因探針對每個樣孔進行PCR篩選，鑒定出陽性孔；（c）把每個陽性孔中的克隆在稀釋到次級多孔板中進行PCR篩選。重復以上程序，直到鑒定出于目的基因對應的單個克隆為止。免疫篩選法：基本步驟與核酸雜交檢測類似，主要過程：先將菌落或噬菌斑影印到硝酸纖維素膜上，再原位溶解菌落釋放抗原蛋白，后用抗體與固定了抗原的膜雜交，抗原抗體結合后，再用標記好的二抗與之反應，最后通過對標記物的檢測便可找到陽性克隆?；蚪MDNA文庫的構建基因組DNA文庫：是指把某種生物的基因組DNA切成適當大小，分別與載體結合后導入微生物細胞，所形成的所有DNA序列的克隆匯總。應用：1、分離特定的基因片段；2、分析特定的基因結構；3、研究基因表達調控；4、構建全基因組物理圖譜和全基因組序列測定。主要過程：1、提取樣品DNA，將所提取的DNA制備成大小適合的隨機DNA片段2、體外將這些DNA片段與適當?shù)妮d體連接成重組子3、將重組子轉化到大腸桿菌或其他受體細胞4、從轉化克隆群中篩選出含有靶基因的陽性克隆。基因組文庫的基本要求：必須具有一定的代表性和隨機性，以保證能從文庫中篩選到某個特定基因。提高基因組文庫代表性的策略：1、用機械切割法或限制性內切核酸酶切割法隨機斷裂DNA，保證克隆的隨機性；2、增加文庫重組克隆的數(shù)目，以提高覆蓋基因組的倍數(shù)。實例：一般常用限制性內切酶部分消化法和?噬菌體載體來構建基因文庫，具體：①提取真核基因組DNA，用可識別4個核苷酸的限制性內切核酸酶Sau3A部分消化基因組DNA，②消化的產物經過瓊脂糖凝膠電泳或蔗糖梯度離心，收集15~20kb范圍的片段；④同時用BamHI消化噬菌體載體（Sau3A和BamHI是同尾酶，前者產生的片段可插入后者切割的缺口）；⑤用T4連接酶將載體與DNA片段相連接，形成重組子；⑥體外包裝后用重組噬菌體侵染大腸桿菌受體細胞；產生噬菌斑，組成包含該真核生物基因組絕大部分序列的DNA文庫。酵母雜交系統(tǒng)1、酵母單雜交系統(tǒng)：原理：將已知的特定順式作用元件構建到最基本啟動子（minimalpromoter，Pmin）的上游，把報告基因連接到Pmin下游；然后將編碼待測轉錄因子cDNA與已知酵母轉錄激活域（AD）融合表達載體導入酵母細胞，該基因產物如果能夠與順式作用元件相結合，就能激活Pmin啟動子使報告基因表達。作用：（1）用于確定某個DNA分子與某個蛋白質分子之間是否存在相互作用；（2）用于分離編碼結合于特定順式調控元件或其他DNA位點的功能蛋白編碼基因；（3）驗證反式轉錄調控因子的DNA結合域；（4）準確定位參與特定蛋白質結合的核苷酸序列。2、酵母雙雜交系統(tǒng)：原理：利用酵母細胞轉錄調控因子具有組件式結構的特征，即該種蛋白由兩種相互獨立的結構域組成（DNA結合結構域-BD；轉錄激活結構域-AD），轉錄因子要發(fā)揮功能需要兩種蛋白相連接。實驗基本過程：首先運用基因重組技術把編碼已知蛋白的DNA序列連接到帶有酵母轉錄調控因子BD編碼區(qū)的表達載體上；然后，導入酵母細胞中使之表達帶有DNA結合域的雜合蛋白，與報告基因上游的啟動調控區(qū)域結合作為“誘餌”來捕獲與已知蛋白相互作用的基因產物；再然后，將已知的編碼AD的DNA分別與帶篩選的cDNA文庫中不同插入片段相連接，獲得AD“獵物”載體去轉化含有“誘餌”的酵母細胞；一旦，酵母細胞中表達的“獵物”蛋白與“誘餌”蛋白相互作用，不同轉錄調控因子的AD和BD就會被牽引靠攏，進而激活報告基因的表達。蛋白質相互作用技術1、等離子表面共振技術（SPR）原理：該技術是將誘餌蛋白結合于葡聚糖表面，將葡聚糖層固定于納米級厚度的金屬膜表面，當有蛋白混合物進過時，如果有蛋白同誘餌蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結合將會使金屬膜表面的折射率上升，從而導致共振角度改變；而共振角度改變與該處蛋白質濃度成正比關系，由此檢測蛋白質之間的相互作用。優(yōu)點：不需要標記物和染料，安全、靈敏、快速還可做定量分析。缺點：需要專門的等離子表面共振檢測儀器。2、免疫共沉淀技術（co-immunoprecipitation，CoIP）基本原理：該技術核心是通過抗體來特異性識別候選蛋白?；具^程：首先，將靶蛋白的抗體通過親和反應連接到固體基質上，再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的大篩選蛋白加入反應體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法在固定基質和抗體的共同作用下將蛋白復合物沉淀到試管底部或微膜上。如果靶蛋白與帶篩選蛋白發(fā)生了相互作用，則這個帶篩選蛋白就會通過靶蛋白與抗體和固體基質相互作用而被分離出來。3、GST及GAD融合蛋白沉降技術基本原理：該技術是利用GST對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質樣品中純化得到相互作用的蛋白質。應用：1、確定探針蛋白與未知蛋白間的相互作用；2、確定探針蛋白與某個已知蛋白之間的相互作用?；具^程：將GST與探針蛋白相結合，然后與谷胱甘肽-瓊脂糖球珠、待測蛋白混合物一起在4℃條件下反應；離心，收集沉淀物；之后用SDS分析。4、熒光共振能量轉移法（FRET）—細胞內蛋白質相互作用研究方法常用探針：熒光蛋白、傳統(tǒng)有機染料和鑭系染料。研究蛋白質間相互作用時，F(xiàn)RET一般與熒光成像技術聯(lián)用，將蛋白標記上探針，當?shù)鞍踪|之間不發(fā)生相互作用時，其相對距離較大，無熒光共振能量轉移現(xiàn)象，而有蛋白質相互作用時，由于相對距離小，則會出現(xiàn)熒光共振能量轉移現(xiàn)象，該過程可直接根據成像照片色彩變化觀察并記錄。5、噬菌體展示技術噬菌體展示技術是將基因表達產物與親和選擇相結合的技術，其基本原理是將編碼“誘餌”蛋白的DNA片段插入噬菌體基因組，并使之與噬菌體外殼蛋白編碼基因相融合。重組的噬菌體在侵染大腸桿菌后，復制形成大量帶有雜合外殼蛋白的噬菌體顆粒，這樣便可直接用于捕獲靶蛋白庫中與“誘餌”蛋白相互作用的蛋白質。DNA-蛋白質相互作用研究技術染色質免疫共沉淀（chromatinimmunoprecipitation，ChIP）—研究活體細胞內染色質DNA與蛋白質相互作用主要實驗流程：1、在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質-DNA復合物，并通過超聲波或酶處理將其隨機切斷為一定長度的染色質小片段；2、然后通過抗原抗體的特異性識別反應，沉淀該復合物，從而富集與目的蛋白質相結合的DNA片段；3、最后通過對目的片段的純化及PCR檢測，獲得該蛋白與DNA相互作用的信息（DNA序列特征、位置、結合時間、親和程度以及基因表達的影響）凝膠滯緩實驗（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA）—體外分析DNA與蛋白質的相互作用基本原理：蛋白質與DNA結合后將大大增加相對分子質量，而凝膠電泳中DNA朝正電極移動的距離與其相對分子質量的對數(shù)成正比，因此，與蛋白質形成復合物的DNA會由于受阻滯而跑得慢。EMSA實驗中：用放射性同位素標記待檢測的DNA片段，然后與細胞提取物共溫育，然再添加到非變性的聚丙烯酰氨凝膠中電泳。通常用32P標記DNA片段，電泳結束后，如果細胞提取物中不存在與DNA相互作用的蛋白質，那么所有放射性標記都會出現(xiàn)在凝膠底部；反之，由于結合蛋白質而受阻滯的原因，放射性標記的DNA條帶會出現(xiàn)在凝膠的不同部位。三種研究基因功能的研究方法基因定點突變技術（site-directedmutagenesis）、基因敲除技術和RNAi技術是當前研究基因功能的三種主要研究方法（技術），基本原理：主要通過全部或部分一直基因的表達，再通過觀察靶基因缺失后生物體的表型變化，從而確定所研究基因的功能。（1）基因定點突變技術：當前基因定點突變技術主要采用基于PCR技術的兩種方法：重疊延伸技術和大引物誘變法。其中（a）重疊延伸技術主要過程：1、首先將模板DNA分別與引物1（正向誘變引物FM和反向誘變引物R2）和引物2（正向引物F2和反向誘變引物RM）退火；2、通過PCR1和PCR2擴增出兩種靶基因片段；3、FM-R2和RM-F2片段在重疊區(qū)發(fā)生退火，用DNA聚合酶補平缺口，形成全場雙鏈DNA后進行PCR3擴增；4、最后，用引物F2和R2通過PCR4擴增出帶有突變位點的全長DNA片段。（b）大引物誘變法基本過程：1、首先通過正向突變引物（M）和反向引物（R1），通過PCR1擴增模板DNA產生雙鏈大引物；2、將大引物與野生型DNA分子混合后退火并使之復性，在第二輪PCR中加入正向引物（F2），與PCR1中產生的第一條互補鏈配對，擴增產生帶有突變的雙鏈DNA；3、獲取定點PCR產物后，進行DNA序列分析以驗證突變位點。（PS：PCR介導的定點突變方法具有的優(yōu)勢：1、突變體回收效率高，以至于不需要再進行突變體篩；2、能用雙鏈DNA作為模板，可以在任何位點引入突變；3、可在同一試管中完成所有的反應；4、快速簡便，無需在M13載體上進行分子克隆。）（2）基因敲除技術：原理：通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，來進行精確的定點修飾和基因改在。基因敲除分類：完全基因敲除、條件型基因敲除；基本操作過程：（a）完全基因敲除，通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中靶基因的活性：實驗中一般采用取代型或插入型載體在ES細胞中根據正-負篩選（P-N-S）原理進行完全基因敲除實驗。正向選擇基因neo通常被插入載體靶基因DNA功能最關鍵的外顯子中，或通過同源重組置換靶基因的功能區(qū)。（neo基因有雙重作用，一方面形成把位點的插入突變，同時可以作為正向選擇的標記；負向選擇基因HSV-tk（皰疹病毒熊腺嘧啶激酶基因）則被置于目的基因片段外側，含有該基因的重組細胞無法在培養(yǎng)基上生長。）由于遺傳重組的自然發(fā)生概率極低，即使采用雙向選擇法（上述）也難保證一次篩選出真正發(fā)生同源重組的胚胎干細胞，之后還需要用PCR及southern印跡法等分子篩選技術驗證目的基因被敲除了的細胞系。（b）條件基因敲除：通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除：條件基因敲除常應用Cre/LoxP和FLP/FRT系統(tǒng)開展；大致過程：構建條件型基因敲除時，常將正向選擇標記neo置于靶基因的內含子中，并在靶基因重要的功能域兩側內含子中插入方向相同的LoxP位點；當實驗需要消除靶基因活性時，只需要與帶有Cre重組酶基因的ES細胞雜交，Cre重組酶就能把兩個LoxP位點中間的DNA偏段切除，導致靶基因失活（PS：標記基因兩側也常常帶有LoxP序列，因為許多時候即使標記基因位于內含子中也會阻斷靶基因的轉錄，一旦發(fā)生這種情況，可以用Cre重組酶表達質粒轉染中靶ES細胞，通過LoxP位點重組將neo抗性基因敲除。）高等動物基因敲除技術：主要技術路線包括構建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法將重組DNA導入胚胎干細胞純系中（使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組）；主要全基因敲除實驗流程（以堿性磷酸酶（IAP）基因敲除為例）：（1）利用Neo基因替換目的基因，得到堿性磷酸酶基因敲除的ES細胞；（2）用顯微注射或電穿孔法將IAP基因敲除的ES細胞注入早期胚胎的囊腔中；（3）誘導胚胎分化，獲得嵌合體后再與野生純合體回交，最終可獲得由ES細胞分化產生的IAP基因敲除小鼠。條件型基因敲除主要實驗過程（肝組織S6基因為例）：（1）首先構建帶有S6基因的LoxP打靶載體的ES細胞；（2）經過雜交篩選獲得純合體小鼠；（3）再與帶有肝組織特異性、受INF-α誘導的Mx-Cre轉基因小鼠雜交；（4）刪除neo基因和外顯子3~5后變得到肝組織特異性敲除S6基因的小鼠。十七、基因工程操作全過程（目的基因獲取、構建表達載體、轉基因操作、陽性克隆的篩選與鑒定）植物基因敲除技術：植物基因敲除常采用T-DNA插入失活技術；原理：利用根瘤農桿菌T-DNA介導轉化，將一段帶有報告基因的DNA序列標簽整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內部或附近，就會影響該基因的表達從而使該基因“失活”。（PS：T-DNA無專一性位點，在植物基因組中發(fā)生隨機整合，所以理論上只要突變株數(shù)量足夠大，就可能獲得任何一個功能基因都發(fā)生突變的基因敲除植物庫）植物基因敲除突變體篩選：由于基因內部或附近插入了一段一直序列的DNA，可據此設計引物用PCR的方法將被破壞的靶基因分離出來；若將靶基因兩端引物LP、RP及插入載體上的引物LB加入同一反應提體系中進行PCR，理論上能得到三條類型的條帶：在野生型植株中只有LP和RP引物配對擴增出來的靶基因條帶；純合型基因敲除植株，只有靶基因一端的引物可以與LB引物配對完成PCR擴增；如果是雜合型基因敲除植株，PCR擴增或會出現(xiàn)兩種條帶。（3）RNAi干涉技術：原理：利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內同源mRNA從而阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。RNAi的作用機制：前體miRNA被釋放到細胞質后，經過Dicer（一種具有RNAaseⅢ活性的核酸酶）加工成雙鏈miRNA，較長的雙鏈RNA（30bp以上）首先被Dicer降解成21~35個核苷酸的小分子干擾核糖核苷酸（siRNA）；siRNA中反義鏈指導合成RNA誘導沉默復合體蛋白（RISC），再有RISC介導切割目的mRNA中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域（部分同源性-翻譯受阻；高度同源性-直接降解），從而實現(xiàn)干擾靶基因表達的功能。PS：少量的siRNA信號也可能被迅速放大的原因：siRNA可作為特殊引物，在依賴RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA為模板合成dsRNA，dsRNA可被降解成siRNA后進入上述循環(huán)。PS2：哺乳動物，較長的dsRNA會導致非特異性基因沉默，短的siRNA才能有效引發(fā)特異性基因沉默；非哺乳動物可直接利用較長的dsRNA誘導RNAi而無需合成siRNA?；蚩寺〖夹g克隆在分子生物學上的定義：將外源DNA插入具有復制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復制的過程。主要有5種方法（技術）：RACE技術、cDNA差示分析法、Gateway大規(guī)模克隆技術、基因圖位克隆法、熱不對稱多聚酶鏈式反應（用于克隆T-DNA）。（1）RACE技術：RACE，即cDNA末端快速擴增法，是一項在已知cDNA序列的基礎上克隆5’端或3’端缺失序列的技術。主要操作步驟：a、獲得高質量總RNA（含有大量完整mRNA、tRNA、rRNA、和部分不完整的mRNA）；b、去磷酸化作用（帶帽子結構的mRNA不受影響）；c、去掉mRNA的5’端帽子結構，加上特異性RNA寡聚接頭并用RNA連接酶相連接；d、以特異性寡dT為引物，在反轉錄酶的作用下，反轉錄合成第一條cDNA（包含了寡接頭的互補序列）；e、分別以第一條cDNA鏈為模板進行REAC反應：（1）5’REAC以5’端RNA寡聚接頭的部分序列和基因特異的3’端反向引物進行PCR擴增，獲得基因的5’端序列。（2）3’REAC以5’端基因特異的引物和3’端寡dT下游部分序列為引物進行PCR擴增，獲得基因的3’端序列。（PS:如果只對3’端序列感興趣，可直接從倒數(shù)第二步開始進行3’REAC）f、將純化后的PCR產物克隆到載體DNA中，進行序列分析。（PS：REAC技術還被用于獲得5’和3’端非轉錄序列，研究起始轉錄位點的不均一性，研究啟動子區(qū)的不保守性）十八、由cDNA證明基因含有內含子、確定內含子比例（2）cDNA差示分析法（RDA）？？？作為染色體步移技術和定位克隆技術等方法的補充，RAD充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴增雙鏈DNA模板，而僅以線性形式擴增單鏈模板的特性，通過降低cDNA群體的復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴增目的基因片段。（3）Gateway大規(guī)模克隆技術？？？該技術利用?噬菌體進行位點特異性DNA片段重組，實現(xiàn)不需要傳統(tǒng)酶切連接過程的基因快速克隆和載體間平行轉移，為大規(guī)?？寺』蚪M注釋的可讀框提供了保障。該技術主要包括TOPO反應和LR反應兩步：TOPO反應將目的基因PCR產物連入Entry載體；LR反應被用于將目的片段從Entry載體中重組入表達載體。(4)基因圖位克隆法（map-basedcloning）—分離位置性狀基因基本過程：首先，通過構建遺傳連鎖圖，將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在位點兩側確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標記；其次，通過對許多不同生態(tài)型個體的大量限制性內切核酸酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的分子標記，通過染色體步移技術將位于這兩個標記之間的基因片段分離克隆出來；最后，再根據基因功能互作原理鑒定目的基因。（5）熱不對稱多聚酶鏈式反應—用于克隆T-DNA作用：TAIL-PCR常用于擴增T-DNA插入位點側翼序列，從而獲得轉基因植物插入位點特異性分子證據。主要過程：該方法使用一套巢式特異性引物（T-DNA邊界引物，TR）和一個短的隨機簡并引物（AD）。第一輪反應（PCR1）是TAIL-PCR的重要環(huán)節(jié)，先進行5個高嚴謹性的循環(huán)，特異性引物TR1與模板退火，只能發(fā)生單引物循環(huán)，T-DNA上游側翼序列得到線性擴增；再者，大幅度降低退火溫度，使AD及TR1均與模板DNA相結合，指數(shù)擴增一個循環(huán)；此后，兩個高嚴謹、一個低嚴謹循環(huán)交替進行，共15個循環(huán)（結果，特異性序列（兩端分別有TR1和AD序列）和非特異性序列1（只有TR1）大大超過非特異性序列2（兩端均為AD））；第二輪反應（PCR2）以特異性引物TR2和AD配對，進行12個TAIL-PCR循環(huán)，特異性序列再次被優(yōu)先擴增，非特異性序列1也大大降低，此時沒有明顯的背景片段。第三輪反應（PCR3）是真正意義上的PCR，用TR3為特異性引物與AD配對，共2個循環(huán)，進一步擴增特異性序列。多聚酶鏈式反應（PCR）基本原理：將雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱分離成兩條單鏈，之后在DNA聚合酶的作用下以單鏈DNA為模板利用反應體系中的四種脫氧核糖核苷酸合成新的DNA互補鏈。（反應體系：模板DNA、PCR引物、dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、緩沖液）反應的基本過程：雙鏈模板DNA首先在高溫下解開成長單鏈，之后斷鏈引物迅速與模板特定序列結合產生雙鏈區(qū)，DNA聚合酶從引物處開始復制合成其互補鏈，迅速產生與目標序列完全相同的復制品。整個過程：DNA解鏈（變性）—引物與DNA模板結合（退火）—DNA合成（延伸）。幾項常用的PCR技術：1、實時定量PCR（realtimequantitativePCR），一項利用帶熒光檢測的PCR儀對整個PCR過程中擴增DNA的累積速率繪制動態(tài)變化圖，從而消除了在測定終端產物豐度時有較大變異系數(shù)問題的PCR技術?；驹恚簾晒馓结槍崿F(xiàn)混合在PCR溶液中，只有與DNA結合后才能夠激發(fā)出熒光。隨著新合成的DNA片段的增加，結合到DNA片段上的熒光探針數(shù)量也在增加，被激發(fā)的熒光也相應增加—所以熒光強度直接反映了被擴增的靶基因總量。PS：常用的熒光探針：1、SYBRGreen1，非特異性，520nm，只能與雙鏈DNA結合。重亞硫酸鹽測序技術—DNA甲基化檢測主要過程：1、將待測DNA樣品用限制性內切酶處理或超聲波破碎等方法打斷成500~1000bp碎片；2、再用重亞硫酸鹽處理使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨作用轉變成尿嘧啶（被甲基化的胞嘧啶由于甲基化保護而不受影響）；3、PCR擴增后該尿嘧啶被測序儀讀取為胸腺嘧啶；4、最后參考原始序列即可判斷源C位點是否發(fā)生甲基化。注意事項：1、重亞硫酸鹽測序分析時必須對同一目標片段進行多次測序（通常為11次），以免產生同源測序（siblingsequencing，是指實驗中所挑取的克隆來源于同一原始DNA模板分子，形成了完全相同的沒有代表性的甲基化模型）；2、由于重亞硫酸鹽測序引物常有簡并位點，造成PCR擴增過程中引物對不同甲基化程度DNA模板分子的親和力不同，使親和力高的模板分子在PCR產物中占高比例，所以經常需要用其他方法做平行試驗。其他檢測甲基化的方法：1、甲基化敏感限制性內切核酸酶法（MS-RE）；2、甲基化特異性PCR（MS-PCR）；3、DNA微陣列法；4、甲基化敏感性斑點分析法（MS-DBA）。其他相關知識概念：1、DNA甲基化（DNAmethylation）：具體指生物體在DNA甲基轉移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體將甲基轉移到特定的堿基上的過程。（DNA甲基化會抑制基因的表達）2、細胞中DNA甲基化的3種狀態(tài)：1、持續(xù)的低甲基化狀態(tài)，如管家基因；2、去甲基化狀態(tài)，如一些發(fā)育階段特異表達的基因；3、高度甲基化，如女性一條失活的X染色體。3、CpG島（CpGisland）：指在基因組的某些區(qū)域中，CpG序列密度達均值的5倍以上所形成的鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)。通常位于基因啟動子區(qū)或第一個外顯子區(qū)。核酸的分離與純化1、凝膠電泳基本原理：在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是呈離子化狀態(tài)，DNA和RNA多核苷酸鏈實際上是呈多聚陰離子狀態(tài)，所以將DNA或RNA放入電場中，它們會由負極向正極移動，且在一定電場強度下，核酸分子的電泳遷移率取決于分子本身大小和結構。凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關：瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍：0.2kb~50kb；聚丙烯酰胺凝膠：1~1000bp；脈沖電場凝膠電泳（PFGE）：>50kb,max=107bp。2、DNA提取純化首先必須破碎或溶解細胞，再用NaCl將DNP抽提出來，再把其中的蛋白質、RNA等雜質除去，即可獲得DNA。主要步驟：（1）細胞裂解和DNA溶解：一般采用機械破碎細胞釋放DNA，另外由于破碎后細胞質中釋放的酶容易使DNA失活，所以該步驟的另一項任務就是對DNA實施快速保護（1、利用液氮在超低溫下研磨，使酶失活；2、快速加入緩沖液并迅速混勻，對細胞溶漿中的DNA進行保護（如緩沖液中的EDTA可以螯合DNA酶輔助因子使酶活性降低等）。（2）去除蛋白質、RNA等雜質：主要利用DNA與蛋白質、多糖等在生化性質上的差異，通過加入離子變性劑、去污劑是蛋白質多糖變性，核蛋白解聚；常用苯酚/氯仿抽提法去除蛋白質多糖，而RNA極易在溶液中降解，必要時可以加入不含DNA酶的RNA酶。（3）DNA的沉淀與純化：將進過除雜的DNA溶液中加入異丙醇沉淀DNA，同時除去殘留的蛋白質多糖；后在用無水乙醇在此沉淀純化；用75%乙醇清洗除去各種離子，再將沉淀DNA溶于TE溶液中，或采用密度梯度離心等方法加以純化，最后便可得到總DNA溶液。常用方法：1、濃鹽法；2、SDS法，SDS能與蛋白質變性結合形成復合物，通過乙酸甲可使復合溶解度變小，從而與DNA分離。3、CATB法，該方法是一種快速提取總DNA的方法，在細胞破碎后即可加入CATB分離緩沖液，將DNA溶解出來，再經氯仿-異戊醇抽提除去蛋白質，最后就可得到總DNA。4、苯酚抽提法，苯酚作為蛋白變性劑同時可以抑制DNA酶的降解，用苯酚處理勻漿時，蛋白質分子溶于酚相，而DNA溶于水相；離心分層后取出水相，多次反復操作，再合并含DNA的水相，最后用乙醇沉淀DNA。蛋白免疫印跡法（westernblotting）-蛋白質檢測基本原理：被測蛋白只能與標記的特異性抗體相結合，而這種結合不改變該蛋白在凝膠電泳中的相對分子質量。作用：檢測樣品中是否存在某一特定蛋白。主要過程：蛋白質樣品制備；SDS電泳分離樣品；將已分離的蛋白質轉移到尼龍膜或硝酸纖維膜等膜上，轉移后首先將膜上未反應的位點封閉起來以抑制抗體的非特異性結合；用固定在膜上的蛋白質作為抗原，結合對應的非標記抗體一；洗去未結合的一抗，加入酶偶聯(lián)或放射性同位素標記的二抗，通過顯色或放射自顯影法檢測凝膠中蛋白質成分。SouthernBlotting-DNA檢測原理：將待檢測的DNA酶切、瓊脂糖凝膠電泳后在堿性條件下變性，再以1.5mol/LNaCl、1mol/LTris（PH=7.4）條件下中和，是DNA保持單聯(lián)狀態(tài)，然后通過毛細管作用或電泳轉移等方式將DNA轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再與標記探針雜交，放射自顯影即可顯示該樣品中是否含有目的基因。NorthernBlotting-RNA檢測原理與方法同Southernblotting相似，不同在于實驗分析材料為總RNA或mRNA，無需經過酶切步驟可直接變性、電泳、轉膜然后雜交檢測?？贵w制備制備主要過程：1、抗原準備；2、動物選擇：常依據抗體的用途和用量來決定，如需要大量制備抗體則選擇體型較大的動物，如果期望獲得直接用于標記診斷的抗體，則應采用與診斷目標相同的動物；3、動物免疫：針對不同的動物及要求的抗體特性不同，需采用不同的免疫劑量、免疫周期來進行動物免疫；在一定范圍內，抗體的效價隨免疫的劑量增加而提高，較長的免疫周期有利于獲得較高效價的抗體血清；4、效價檢測：可采用試管凝集法、瓊脂擴散實驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）等檢測效價；5、采集血清，純化抗體；6、獲得抗體并進行純度及特異性鑒定?；虮磉_研究技術1.基因芯片技術—基因組水平上各轉錄物變化規(guī)律基因芯片（DNAchip）又稱DNA微陣列技術（DNAmicroarray），是利用一種小型裝置，來快速和精確地研究生物體、組織、器官或細胞內基因組的遺傳信息。基本過程原理：1、制作芯片時，可用機械臂將大量已知或未知基因序列的DNA片段點在玻璃片、金屬片或尼龍膜上，在經過物理吸附作用使其固定化。（也可以直接在玻璃板或金屬板表面基因化學合成，從而得到寡核苷酸芯片）2、將芯片與待研究的cDNA或其他樣品雜交，經過計算機掃描和數(shù)據處理，便可觀察到成千上萬基因在不同組織或同一組織不同發(fā)育時間或不同生理條件下的表達情況。（PS：原理2：熒光標記的cDNA與芯片上相匹配的DNA序列發(fā)生雜交反應，使得芯片上的點呈現(xiàn)出熒光信號，信號強度和基因的表達豐度成正相關）基因芯片技術研究的一般的5步驟：提出問題、制備樣品、生化反應、檢測和數(shù)據模型分析。十三、操縱子攜帶基因導入大腸桿菌的遺傳操作2.原位雜交技術—核酸定位、定量研究原位雜交（ISH）是用標記的核酸探針，經放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段。通常分為：RNA原位雜交和染色體原位雜交兩大類；RNA原位雜交：用放射性或非放射性（如生物素）標記的特異性探針與固定的組織切片反應，若細胞中存在于探針互補的mRNA分子，兩者雜交產生雙鏈RNA，就可以通過檢測放射性標記或經酶促免疫顯色，從而對該基因表達產物在細胞水平上做出定性定量分析。熒光原位雜交（FISH）：首先對寡核苷酸探針做特殊處的修飾和標記，然后用原位雜交法與靶基因染色體或DNA上特定的序列結合，再通過與熒光素分子向偶聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。3.轉錄組測序—基因表達系列分析（SAGE）SAGE是一種以DNA序列測定為基礎定量分析全基因組表達模式的技術，能夠直接讀出任何一種細胞類型或組織的基因表達信息。原理依據：1、一個9~10堿基的短核苷酸序列標簽包含有足夠信息，能夠唯一確認一種轉錄物；2、如果能將9堿基的標簽集中于一個克隆中進行測序，并將得到的短序列核苷酸順序以連續(xù)數(shù)據形式輸入計算機中進行處理，就能對數(shù)以千計的mRNA轉錄物進行分析。SAGE操作的主要過程：分離提取mRNA—反轉錄反應合成cDNA—用特定的限制性核酸內切酶（錨定酶）酶切—分離3’端酶解片段，分兩份，分別與接頭相連—用標簽酶酶切，形成雙標簽—根據連接子設計引物，進行PCR擴增—經PAGE電泳回收目的條帶，用錨定酶酶切，分離純化雙標簽并串聯(lián)入載體中—篩選，測序，進行基因的鑒定和表達頻率分析。優(yōu)點：高靈敏度，能大規(guī)模檢測；能檢測所有基因（包括位置基因）的定量數(shù)據；避免了擴增時的偏倚；大量數(shù)據可用于多重比對。RNA選擇性剪切技術選擇性剪接（alternativesplicing）是指用不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點組合）從一個mRNA前體產生mRNA剪接異構體的技術過程。一般剪接分為：平衡剪接、5’選擇性剪接、3’選擇性剪接、外顯子遺漏性剪接和相互排斥性剪接。最后可以用RT-PCR來研究基因是否存在選擇性剪接。蛋白質磷酸化分析技術蛋白激酶體外磷酸化活性分析，主要分為獲取底物蛋白或待檢測蛋白激酶和進行蛋白質體外磷酸化反應兩步：①直接從組織中提取，也可以由原核或真核表達載體誘導表達得到底物蛋白或待檢測蛋白激酶；②將底物蛋白聚合到聚丙烯酰胺分子中，再將待檢測的蛋白激酶上樣后電泳，結束后洗去SDS，再加入γ-32P-ATP的反應液孵育12h（γ-32P-ATP的γ基團會在蛋白激酶的作用下轉移到底物蛋白上）；③用三氯乙酸終止反應，洗去未反應的γ-32P-ATP，再用放射自顯影法檢測與P標記的γ磷酸基團相結合的底物蛋白，確定蛋白激酶及其活性。細胞定位及染色技術常用的定位方法有熒光蛋白標記法和免疫熒光法。熒光蛋白標記法的基本原理：將綠色熒光蛋白編碼基因與目的基因的啟動子融合形成嵌合基因，或者與目的基因編碼序列融合，構成融合基因，轉入受體細胞后通過熒光蛋白的熒光效應在熒光顯微鏡下便可觀察并確定目的蛋白在細胞中分布情況。免疫熒光法基本原理：用針對特異蛋白抗原的熒光標記抗體作為分子探針檢測細胞或組織內的相應抗原，利用熒光效應對抗原蛋白進行細胞定位。基因工程與操作技術基因工程是通過基因操作，將目的基因或DNA片段與合適的載體連接轉入目標生物細胞，通過復制、轉錄、翻譯外源目的基因以及蛋白質的活性表達，使轉基因生物獲得新的遺傳性狀的操作過程?；虿僮鳎悍褐笇蜻M行分離、連接、轉化等分子生物學操作，是基因工程的技術基礎?；蚬こ碳夹g流程：（1）克隆目的基因，從特定的生物基因組或cDNA中通過各種方法分離和PCR擴大繁殖獲得足夠量目的基因或cDNA序列；（2）載體準備，選擇合適的載體，并對載體DNA進行克隆，制備足夠的且達到一定純度的載體DNA；（3）目的基因與載體連接，通過限制酶剪切和連接酶的連接作用，將目的基因連接于載體的多克隆位點或啟動子和終止子之間，實現(xiàn)DNA重組；（4）重組DNA導入受體細胞，通過轉化、轉導、轉染或顯微注射等方法將重組DNA導入受體細胞中；（5）重組體的篩選與鑒定，利用載體上的選擇標記基因進行篩選，以獲得具有重組DNA分子的重組細胞，此外還需對所獲得的轉化細胞（轉基因動植物）進行分子鑒定；（6）重組體的大量培養(yǎng)，外源基因表達效應分析，將經篩選和鑒定出來的大腸桿菌等轉化細胞進行大量繁殖，對外源基因表達蛋白進行分離純化并進行后續(xù)結構功能分析的研究；分析外源基因表達對情況及其對動植物性狀的影響?；蚬こ讨饕獞眉夹g：1、DNA、RNA的分離與檢測；2、凝膠電泳分析技術；3、分子雜交技術；4、DNA的酶切、連接與細菌的轉化技術（基因操作技術）；5、PCR；6、DNA序列分析技術；7、核苷酸合成技術；8、基因定點突變技術；9、分子相互作用分析技術；10、細胞培養(yǎng)與再生技術。轉基因動植物的檢測鑒定答：一、個體水平檢測：如所導入的基因可改變轉基因個體的外觀形狀則可通過直接觀察來初步確定該個體是否為轉基因個體；二、分子水平檢測：（1）DNA分子檢測1、Southern雜交：提取基因組DNA，進行酶切消化，電泳后將DNA轉印至膜上，用外源目的基因的一些片段作探針與之雜交，通過放射自顯影，在膜上便可獲知該基因組DNA中是否含有外源轉入的基因。此法雖然復雜，對低拷貝轉基因動物易漏檢，但通過適當?shù)拿盖邢纱_定整合的外源基因的完整性，且在轉基因動物的內源性基因和外源性基因的同源性較高時，Southern雜交是最為可靠的方法。2.斑點雜交法：較Southern雜交方法簡單，提取轉基因動物的基因組DNA后，直接點在載體膜上，用外源目的基因片段作為探針進行雜交，通過顯影獲得雜交結果。此法雜交結果不可靠，在轉基因動物的內源性基因和外源性基因的同源性高時，檢測結果的假陽性高。3、PCR法提取基因組DNA，根據外源基因設計特異的檢測引物，對轉基因動物的基因組DNA進行PCR擴增，電泳