免疫細(xì)胞的分離技術(shù)

免疫細(xì)胞的別離2024/11/71.免疫細(xì)胞1、概念直接參與免疫應(yīng)答及與免疫應(yīng)答相關(guān)的所有細(xì)胞。2、分類＊單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)：單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞〔DCs)＊淋巴細(xì)胞系統(tǒng)：T淋巴細(xì)胞〔Th/Tc) B淋巴細(xì)胞NK細(xì)胞＊粒細(xì)胞系統(tǒng):中性粒細(xì)胞 噬酸性粒細(xì)胞 噬堿性粒細(xì)胞2024/11/72.免疫細(xì)胞的別離人外周血單個(gè)核細(xì)胞的別離淋巴細(xì)胞的別離免疫細(xì)胞亞群的別離2024/11/73.細(xì)胞別離原理細(xì)胞的大小和比重細(xì)胞外表標(biāo)志細(xì)胞黏附于各種物質(zhì)外表的特性2024/11/74.一、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的別離

——Ficoll分層離心法人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC):Monocyte、Lymphocyte。原理：血液中各細(xì)胞成分的比重不同，經(jīng)離心沉淀，即可在分層液與血漿之間獲得比較純的單個(gè)核細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞占90%以上。

2024/11/75.不同細(xì)胞密度不同

紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞1.092

單個(gè)核細(xì)胞1.070

分層液1.077

2024/11/76.一、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的別離

——Ficoll分層離心法

Ficoll分層液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。2024/11/77.二、淋巴細(xì)胞的別離

尼龍棉柱法E花環(huán)別離法補(bǔ)體細(xì)胞毒法免疫熒光法

2024/11/78.二、淋巴細(xì)胞的別離

——尼龍棉柱法原理：B細(xì)胞和單核細(xì)胞具有易黏附的特性，將淋巴細(xì)胞懸液加至尼龍纖維柱上，37℃作用1~2h后，洗脫的為非黏附性的T細(xì)胞。PBMC尼龍纖維棉柱B細(xì)胞單核細(xì)胞T細(xì)胞2024/11/79.二、淋巴細(xì)胞的別離

—E花環(huán)別離法〔純化T細(xì)胞〕原理＊成熟T細(xì)胞外表有綿羊紅細(xì)胞受體〔E受體，CD2分子〕，可和SRBC形成E花環(huán)，B細(xì)胞那么無。＊E花環(huán)比重大，沉淀，經(jīng)別離液別離來。＊E花環(huán)周圍的綿羊RBC可用低滲法除去。.三、免疫細(xì)胞亞群的別離免疫磁珠別離法流式細(xì)胞術(shù)2024/11/711.三、免疫細(xì)胞亞群的別離

—免疫磁珠別離法原理：將抗體交聯(lián)于磁珠外表形成免疫磁珠〔Immunomagneticbead，IMB〕，免疫磁珠直接或者間接偶聯(lián)在抗體上，從而與細(xì)胞相連，在高強(qiáng)度、梯度磁場(chǎng)中到達(dá)細(xì)胞磁性別離的目的。2024/11/712免疫細(xì)胞的別離.三、免疫細(xì)胞亞群的別離

—免疫磁珠別離法1.直接法：抗細(xì)胞外表分子抗體+磁性微球免疫磁珠+細(xì)胞懸液與免疫磁珠結(jié)合的細(xì)胞2.間接法：第二抗體+磁性微粒第一抗體+細(xì)胞特定細(xì)胞...免疫磁珠法分選裝置.三、免疫細(xì)胞亞群的別離

—流式細(xì)胞術(shù)〔FlowCytometry，F(xiàn)CM〕FCM將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的外表標(biāo)志〔抗原或受體〕進(jìn)行快速、精確的分析和自動(dòng)檢測(cè)，并將不同類型的細(xì)胞分選收集。原理：細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動(dòng)系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個(gè)流經(jīng)檢測(cè)區(qū)。當(dāng)細(xì)胞從流動(dòng)室噴嘴處流出時(shí)，超聲震動(dòng)液流，使液流段裂成一連串的均勻小滴，每個(gè)小滴內(nèi)最多含一個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號(hào)，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞類型。2024/11/717.流式細(xì)胞儀工作原理2024/11/718.流式細(xì)胞儀2024/11/719.免疫細(xì)胞的別離人外周血單個(gè)核細(xì)胞的別離——Fi