DB41T 1589-2018 飼料中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)EMA-PCR法

DB41DB41/T1589—2018飼料中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)EMA-PCR法2018-04-17發(fā)布2018-07-17實(shí)施河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB4789.30食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞4.32×PremixTaq緩沖液：內(nèi)含TaqDNA聚合酶1.25a）上游引物：5＇-GATGACGAAATGGCTTACAGTGAAT-3';4.10疊氮溴化乙錠（EMA，0.2mg/mL見(jiàn)附錄A的A.4。4.11溴化乙錠（10mg/mL）。4.12滅菌離心管：1.5mL，15mL。25.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。取25g試樣于225mL李氏增菌肉湯LB1（4.2）中，充分混勻，30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。取0.1mL預(yù)取1mL增菌液至離心管中，12000r/min離心2min，棄上清。加入1mL滅菌水懸浮沉淀物，12000r/min離心2min，棄上清，重復(fù)洗滌一次。加適量滅菌水懸浮沉淀物并調(diào)節(jié)菌懸液濃度至0.5麥將離心管開(kāi)蓋置于冰上，鹵素?zé)粽丈湎缕毓?min，然后水浴煮沸15min，再將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中使其快速冷卻15min。渦旋混勻裂解物，12000r/min離心2min，收集上清稱取1.5g瓊脂糖（4.5）加入100mL1×TAE電泳緩沖液（4.8）中，加熱使其充分熔化，冷至65℃3泳20min～30min。如果單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽(yáng)性對(duì)照的PCR產(chǎn)物在271bp處出現(xiàn)條帶（參見(jiàn)附錄B），照PCR產(chǎn)物于271bp處未出現(xiàn)條帶，則檢測(cè)結(jié)果成立；否樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在271bp處出現(xiàn)條帶，則為疑似陽(yáng)性樣品，此時(shí)需按GB4789.30進(jìn)行確證，樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在271bp處未出現(xiàn)條帶，判定25g樣品中未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。4培養(yǎng)基和試劑A.1.1成分胰胨5.0g多價(jià)胨5.0g酵母膏5.0g氯化鈉20.0g磷酸二氫鉀1.4g磷酸氫二鈉12.0g七葉苷1.0g水1000mLA.1.2制法A.1.2.1李氏增菌肉湯LB1每221%萘啶酮酸（用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制）0.5mL0.3mLA.1.2.2李氏增菌肉湯LB2每201%萘啶酮酸0.4mL0.5mLA.2.1成分242.0g37.2g57.1mL942.9mLA.2.2制法調(diào)節(jié)至pH8.3，定容至1L后，室溫保存。使用時(shí)稀釋50倍即為5A.3.1成分0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0）0.5g0.5g0.06mL360mL640mLA.3.2制法0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶于500mL滅菌水中，加入溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF溶解，與甘油混合，定容至1000mL，分裝后4℃保存。A.4.1成分疊氮溴化乙錠5mg滅菌水25mLA.4.2制法5mg疊氮溴化乙錠溶于5mL滅菌水中，定容至