腦科學(xué)研究的方法

多學(xué)科綜合第一章腦科學(xué)研究的方法和手段多層次的研究研究水平整體行為水平：行為學(xué)，軀體感覺，視聽覺，痛覺等

細(xì)胞水平：神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、生物電活動(dòng)檢測(cè)、通路示蹤、細(xì)胞染色、免疫化學(xué)、凋亡檢測(cè)分子水平的實(shí)驗(yàn)：離子通道、受體、酶、遺傳物質(zhì)等一、形態(tài)學(xué)方法二、生理學(xué)方法三、電生理學(xué)方法四、生物化學(xué)方法五、分子生物學(xué)方法六、腦成像（Brainimaging）技術(shù)一、形態(tài)學(xué)方法常規(guī)染色和特殊染色束（通）路追蹤法

熒光組織化學(xué)法原位雜交法受體定位法神經(jīng)系功能活動(dòng)形態(tài)定位法

1.常用普通染色方法TTC染色HE鋨酸染色氯化金浸染Cajal銀浸染色尼氏染色HE（蘇木素－伊紅）鋨酸染色是神經(jīng)科學(xué)研究的一種常用而普遍的方法，它本來是用來固定脂質(zhì)的，由于髓鞘的主要成分是脂質(zhì)，所以用于有髓神經(jīng)纖維的染色

鋨酸染色氯化金浸染運(yùn)動(dòng)終板Ach熒光染色氯化金浸染Cajal銀浸染色尼氏染色多種方法，HE、甲苯胺藍(lán)，焦油紫，硫堇，天青，派洛寧，中性紅以及棓花青等堿性苯胺染料均可以使尼氏體著色2、束（通）路追蹤法：研究神經(jīng)元之間的聯(lián)系

束路追蹤原理：軸漿運(yùn)輸示蹤物質(zhì)：HRP，熒光染料，各種標(biāo)記物標(biāo)記的葡萄糖，放射性核素標(biāo)記的氨基酸等。觀察：根據(jù)示蹤物質(zhì)不同，采用組織顯色、熒光顯微鏡或放射自顯影等方法。軸漿運(yùn)輸法—利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸現(xiàn)象的追蹤法.

追蹤劑：辣根過氧化物酶(horseradishperoxoidase,HRP)、熒光染料包括核黃(nuclearyellow)、固藍(lán)(fastblue)及熒光金(fluorogold)、植物凝集素如麥芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)和菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin)、細(xì)菌毒素如霍亂毒素、病毒如活的神經(jīng)病毒

(胞疹病毒和彈狀病毒）

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變性法：利用神經(jīng)元包體受損或神經(jīng)軸突離斷后遠(yuǎn)側(cè)軸突的變性，或軸突切斷后細(xì)胞的反應(yīng)，來研究纖維的聯(lián)系。*物理性方法：刀的切割、電凝、電離破壞、超聲破壞等。*化學(xué)性破壞：興奮性氨基酸（海人酸和鵝高蕈氨酸）、單胺類神經(jīng)毒（６－羥多巴胺、６－羥多巴、雙羥色胺）

神經(jīng)元質(zhì)膜熒光染料法：

用羰花青（carbocynine）熒光染料，可以染出神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜，并可以在活體或固定的標(biāo)本上追蹤纖維聯(lián)系。

最新研究進(jìn)展：

華人學(xué)者繪制小鼠大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖不同的大腦區(qū)域必須相互溝通才能控制復(fù)雜的思想和行為，但目前對(duì)于這些區(qū)域組織成為廣闊神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制卻相對(duì)知之甚少。2014年2月27日《細(xì)胞》（Cell）雜志上的一項(xiàng)新研究中，南加州大學(xué)董宏偉等研究人員采用神經(jīng)元示蹤技術(shù)繪制出了一張小鼠全腦圖譜，揭示了大腦皮質(zhì)中數(shù)百條神經(jīng)元通路。在顯微鏡下將可見的熒光分子注入到整個(gè)小鼠大腦皮質(zhì)的不同區(qū)域，這些小分子沿著“細(xì)胞高速公路”運(yùn)輸，標(biāo)記了大約600個(gè)神經(jīng)元通路。研究人員采用高分辨率顯微鏡掃描了這些大腦區(qū)域，構(gòu)建出了皮質(zhì)連接的圖像數(shù)據(jù)庫(kù)。當(dāng)研究人員分析這些連接時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)是一個(gè)高度組織化的網(wǎng)絡(luò)，由八個(gè)子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，它們協(xié)調(diào)活動(dòng)反映動(dòng)物的情感和感覺。并且，子網(wǎng)絡(luò)之間以一種非常特殊的方式來共享這一信息?！斑@些研究發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了流行假說：大腦皮質(zhì)是一個(gè)單一的網(wǎng)絡(luò)，在這一網(wǎng)絡(luò)中所有一切都密集連接在一起?！苯酉聛恚芯咳藛T可將來自這一重要哺乳動(dòng)物模型系統(tǒng)的解剖數(shù)據(jù)與大量現(xiàn)有的分子遺傳數(shù)據(jù)合并來鑒別神經(jīng)細(xì)胞基本類型?！按_定全腦的結(jié)構(gòu)組織將是朝著揭示腦功能以及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中功能障礙的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)邁出的基本且令人興奮的一步，”董宏偉說。我們真的會(huì)永遠(yuǎn)不老嗎？——從“科學(xué)狂人”的抗衰老研究說起JohnCraigVenter的身上從不缺乏話題。從單槍匹馬與人類基因組計(jì)劃展開競(jìng)爭(zhēng)、時(shí)代雜志將他與人類基因組計(jì)劃代表FrancisCollins同時(shí)選為封面人物，到宣布制造出首個(gè)能夠自我復(fù)制的活細(xì)胞“Synthia”，轟動(dòng)了整個(gè)學(xué)術(shù)界，Venter的每一個(gè)舉動(dòng)，在學(xué)術(shù)界都會(huì)引起波瀾。前陣子，他又宣稱將組建新公司HLI，組建史上最大的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合基因組學(xué)、生物信息學(xué)及干細(xì)胞療法，致力于抗衰老研究，并延長(zhǎng)人類壽命?！緸槭裁次覀儠?huì)追求不老和長(zhǎng)壽】對(duì)于不老和長(zhǎng)壽的探索，恐怕是除了“我們是誰”“我們從哪兒來”之外，人們思考的第三個(gè)問題了——“我們能否一直存在下去”。【對(duì)衰老和長(zhǎng)壽的基因研究】有一個(gè)規(guī)律，很多問題，如果解釋不了，就說它是由于基因決定的，多半錯(cuò)不到哪里去。也因此，生物學(xué)家、醫(yī)學(xué)家們紛紛開始將遺傳學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合，從基因的角度開始對(duì)長(zhǎng)壽和衰老問題的探索。目前基因方面的研究主要有兩個(gè)方向，長(zhǎng)壽基因和衰老基因。這里說的并不是單一的基因，而是與長(zhǎng)壽和衰老有關(guān)的多種基因，它們之間的相互作用帶來了不老和長(zhǎng)壽的結(jié)果。衰老的表現(xiàn)為染色體端粒長(zhǎng)度的改變、DNA損傷、甲基化等，衰老的終點(diǎn)就是死亡，這些因素也是影響長(zhǎng)壽的原因。有科學(xué)家認(rèn)為，端粒（細(xì)胞核兩端的特殊DNA片段）長(zhǎng)度決定生物的壽命，端粒的縮短會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂的停止和死亡的來臨。發(fā)現(xiàn)端粒的三位科學(xué)家獲得了2009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。目前“長(zhǎng)壽基因”和“衰老基因”還不能完全確定，但有學(xué)者認(rèn)為，消除自由基的某些酶類基因、與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控有關(guān)的某些基因與長(zhǎng)壽和衰老相關(guān)。對(duì)于長(zhǎng)壽和衰老基因，科學(xué)上還需要繼續(xù)發(fā)現(xiàn)更多的相關(guān)基因，理清那些導(dǎo)致衰老、影響長(zhǎng)壽的基因群及其之間的聯(lián)系，才能在理解基因組的基礎(chǔ)上，解決衰老、長(zhǎng)壽的問題。【其他長(zhǎng)壽和抗衰老的辦法】除了基因研究外，還有抗衰老制劑的研究。褪黑素與微量元素是被認(rèn)為有抗衰老作用的物質(zhì)。褪黑素的自由基清除能力在眾多自由基清除劑中表現(xiàn)特別突出，而微量元素?cái)z入不協(xié)調(diào)，將導(dǎo)致衰老。還有一種說法，節(jié)食能夠延長(zhǎng)壽命。這背后的生物學(xué)原理是：生長(zhǎng)激素和胰島素信號(hào)途徑在起作用?？茖W(xué)家通過對(duì)猴子、酵母菌、果蠅等動(dòng)物的研究中驗(yàn)證了減少卡路里攝入能夠延長(zhǎng)壽命的理論。另一些科學(xué)家提出引起機(jī)體衰老和疾病的是自由基的增多，這也是現(xiàn)實(shí)生活中那些宣稱“清除自由基，恢復(fù)年輕態(tài)”的保健品所依賴的理論基礎(chǔ)。這些保健品療效有限，請(qǐng)不要輕易嘗試。除了遺傳因素之外，人生活的環(huán)境、人的心理狀況等多方面因素都會(huì)影響到壽命。保持愉悅的心情，健康的生活方式，良好的飲食習(xí)慣，這樣即使軀體不可避免的老化，但還是有年輕的心態(tài)，總好過長(zhǎng)壽但不快樂，年輕的外表下，卻住著一個(gè)老靈魂。對(duì)于長(zhǎng)壽基因及衰老基因的發(fā)掘，也有不贊同的聲音。他們認(rèn)為這違反了倫理道德，假使我們不老不死，那么進(jìn)化的要領(lǐng)“生存和繁殖”，也會(huì)越來越少的被考慮，我們將剝奪后代的生存機(jī)會(huì)。技術(shù)的進(jìn)步帶來的潛在社會(huì)問題，還有待進(jìn)一步去解決。就目前的研究狀況來看，長(zhǎng)壽不意味著不會(huì)永生，科學(xué)的幫助下，人們有機(jī)會(huì)將有限的生命拉長(zhǎng)，將有限的生命過得更有質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)不老不病的愿望。此時(shí)又想到了Venter先生，據(jù)悉，Venter曾作為美國(guó)海軍醫(yī)療隊(duì)的醫(yī)院參加越戰(zhàn)，戰(zhàn)場(chǎng)的殘酷使他認(rèn)識(shí)到生命和時(shí)間的寶貴，他認(rèn)為人生的每一分鐘都應(yīng)該有所創(chuàng)新。撇開進(jìn)化的需要不談，試想有一天，我們不再會(huì)變老，沒有疾病，壽命很長(zhǎng)，我們是否還會(huì)像出生即知將死的時(shí)候那樣，珍惜生命中的每一天，而努力奮斗呢。3、熒光組織化學(xué)法

用特異性抗體顯示神經(jīng)組織化學(xué)成分的方法?；具^程有：固定、制片、反應(yīng)等三步。

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免疫組織化學(xué)反應(yīng)：有直接法和間接法

l雙重免疫組織化學(xué)染色：主要是為了研究?jī)煞N物質(zhì)在同一細(xì)胞或突起內(nèi)的共存現(xiàn)象，或含兩種不同化學(xué)物質(zhì)的相互關(guān)系。免疫組化根據(jù)二抗標(biāo)記的不同（熒光素、酶、鐵蛋白、膠體金或銀標(biāo)記），免疫組化包括免疫熒光、免疫酶組織化學(xué)、免疫金銀及鐵標(biāo)記技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA和DNA序列片段，原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)?；驹硎歉鶕?jù)兩條單鏈核苷酸互補(bǔ)堿基序列專一配對(duì)的特點(diǎn)，應(yīng)用已知堿基序列并具有標(biāo)記物的RNA或DNA片段即核酸探針（probe），與組織切片或細(xì)胞內(nèi)的待測(cè)核酸（RNA或DNA片段）進(jìn)行雜交，通過標(biāo)記物的顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位。4、原位雜交法

此項(xiàng)技術(shù)需首先制備某種核酸探針，其種類主要有三種：①利用大肝桿菌重組帶有目的基因的質(zhì)粒DNA，制成互補(bǔ)DNA探針(cDNA)；②應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶消化制成線性DNA模板，在體外轉(zhuǎn)錄獲得反義RNA探針(cDNA)；③依照待測(cè)核酸的核苷酸序列，應(yīng)用DNA合成儀合成寡聚核苷酸探針。cRNA和cDNA的常用標(biāo)記物有32S、32P、3H等放射性核素和熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)。組織學(xué)應(yīng)用的原位雜交術(shù)主要是染色體原位雜交和細(xì)胞原位雜交。前者是研究遺傳基因、抗原基因、受體基因、癌基因等在染色體上的定位與表達(dá)；后者是研究細(xì)胞某種蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄物mRNA在胞質(zhì)內(nèi)的定位與表達(dá)。核酸分子雜交術(shù)有很高的敏感性和特異性，它是免疫細(xì)胞化學(xué)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從分子水平探討細(xì)胞功能的表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制的，已成為當(dāng)前神經(jīng)生物學(xué)研究的重要手段。5、受體定位法：研究受體在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的定位

配體法：主要在組織切片上進(jìn)行，利用標(biāo)記的配體和受體結(jié)合以示蹤其部位

免疫組織化學(xué)法：用針對(duì)受體的抗體6、神經(jīng)系功能活動(dòng)形態(tài)定位法

脫氧葡萄糖法：原理是：神經(jīng)元活動(dòng)時(shí)其能量代謝增加，而其能量代謝主要依賴葡萄糖。在腦內(nèi)存在脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2DG)時(shí)，神經(jīng)元可不加區(qū)別地將2DG與葡萄糖一起攝入細(xì)胞內(nèi)，兩者都是己糖激酶的底物。但2DG在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被磷酸己糖異構(gòu)酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為果糖-6-PO4，不能繼續(xù)在糖酵解循環(huán)中代謝。如在2DG上標(biāo)以同位素。神經(jīng)元內(nèi)同位素的堆積程度反映了神經(jīng)元的活動(dòng)程度。

c-fos(Fos)法：

c-fos是一種原癌基因，屬于即刻－早期基因類(immediate-earlygene).很多刺激條件可通過第二信使引起神經(jīng)元c-fos的表達(dá)增加，形成fosmRNA。由fosmRNA翻譯成的Fos蛋白，立即轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，與另一即刻早基因c-jun所產(chǎn)生的蛋白Jun構(gòu)成二聚體（第三信使），調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，引起一系列的細(xì)胞反應(yīng)。

細(xì)胞色素氧化酶法：

神經(jīng)元線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶是提供神經(jīng)元能量的重要酶，細(xì)胞色素氧化酶的水平與神經(jīng)元能量需求密切相關(guān)，一般反映慢性刺激的結(jié)果。

二、生理學(xué)方法

損毀法

刺激法周身給藥法腦室注射法腦組織培養(yǎng)亞細(xì)胞分析神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的測(cè)定

神經(jīng)遞質(zhì)的功能測(cè)定

行為學(xué)方法

最常用的有兩種：神經(jīng)行為學(xué)、電生理學(xué)1、神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的測(cè)定（在體invivo和離體invitro)推挽灌流法：

在體研究中樞核團(tuán)遞質(zhì)釋放的有用方法。通過推挽灌流套管，使灌流液直接灌流腦組織，從流出液中分析神經(jīng)遞質(zhì)的變化。

腦透析術(shù)(braindialysis)：在特定的腦區(qū)內(nèi)，植入透析探頭，用生理溶液灌流時(shí)，細(xì)胞外液中的神經(jīng)遞質(zhì)可順濃度遞度從透析管擴(kuò)散至灌流液中，收集和測(cè)定灌流液中神經(jīng)遞質(zhì)的含量，就能監(jiān)測(cè)該遞質(zhì)的變化過程。腦透析術(shù)的裝置包括探頭、導(dǎo)管、微量灌流泵、樣品收集器和定量分析儀。

抗體微探針法：是在玻璃微電極上涂上一層神經(jīng)肽抗體，用于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)定位神經(jīng)肽的釋放。硼硅玻璃與r－氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri-etriethoxysilane）反應(yīng)后在玻璃表面形成一層帶有游離氨基的硅氧烷(siloxane)多聚體微粒。該玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)處理，使戊二醛與蛋白質(zhì)A以共價(jià)鍵方式偶聯(lián)，蛋白質(zhì)A再與神經(jīng)肽抗體結(jié)合，制成抗體微探針腦片灌流法

突觸體灌流法2、神經(jīng)遞質(zhì)的功能測(cè)定

微電泳：能將微量的神經(jīng)遞質(zhì)導(dǎo)入神經(jīng)元附近，觀察其作用?？贵w微量注射：特異性的抗體注射在某些部位，可中和神經(jīng)末梢釋放出而進(jìn)入突觸間隙的神經(jīng)肽，防止其與受體結(jié)合。因此，抗體微量注射所引起的功能變化可解釋為消除該神經(jīng)肽的生理效應(yīng)的結(jié)果。生物檢測(cè)（Bioassay）:經(jīng)典的方法.如用水蛭背最長(zhǎng)肌測(cè)定ACh的作用，靈敏度達(dá)10-10g.3、行為學(xué)方法

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經(jīng)典條件反射：代表了刺激與強(qiáng)化的關(guān)系。l操作式條件反射：是通過動(dòng)物自身的某個(gè)特定操作動(dòng)作而獲得食物或回避有害刺激的反應(yīng)活動(dòng)。

Behavioralneuroscienceisthestudyoftheneuralmechanismsmediatingnormalandabnormalbehaviors.自主活動(dòng)動(dòng)物焦慮檢測(cè)：實(shí)施焦慮因素，如飲食或飲水剝奪，檢測(cè)反應(yīng)，可以用于藥物篩選。性和生殖行為：進(jìn)化，神經(jīng)內(nèi)分泌作用機(jī)制學(xué)習(xí)記憶攝食行為驚恐反射社會(huì)行為

……..自主活動(dòng)箱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自主活動(dòng)標(biāo)志著動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮狀態(tài)，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮時(shí)，自主活動(dòng)加強(qiáng)，抑制時(shí)則自主活動(dòng)減少。觀察動(dòng)物自主活動(dòng)是評(píng)價(jià)中樞神經(jīng)興奮狀態(tài)的一項(xiàng)主要指標(biāo)。多種作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物都可影響動(dòng)物的自主活動(dòng)，因而自主活動(dòng)的記錄是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的主要方法，而且在新藥研究中，觀察藥物對(duì)動(dòng)物自主活動(dòng)的影響也是評(píng)價(jià)藥物是否影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要方法．自主活動(dòng)箱實(shí)驗(yàn)主要技術(shù)指標(biāo)：運(yùn)動(dòng)次數(shù)洞板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠自動(dòng)活動(dòng)，可用于新藥，一般藥理，神經(jīng)系統(tǒng)的研究和中樞興奮性，抑制性研究。主要技術(shù)指標(biāo)：小鼠探洞次數(shù)。學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)檢測(cè)

學(xué)習(xí)記憶功能包括空間學(xué)習(xí)記憶功能和非空間學(xué)習(xí)記憶功能。隨著對(duì)大腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制研究的不斷深入以及尋找有效防治認(rèn)知障礙類疾病方法的需要，使得動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)成為研究腦高級(jí)功能及其他神經(jīng)科學(xué)的不可缺少的重要手段，客觀準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶水平已成為神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)中非常重要的研究?jī)?nèi)容。學(xué)習(xí)記憶功能檢測(cè)的常用實(shí)驗(yàn)程序空間學(xué)習(xí)記憶任務(wù)非空間學(xué)習(xí)記憶任務(wù)Morris水迷宮T迷宮6或8臂放射狀水迷宮LashleyⅢ

迷宮放射狀迷宮（8臂、12臂）H-W迷宮Y迷宮新奇物體認(rèn)知環(huán)形平臺(tái)嗅覺辨別T迷宮穿梭箱實(shí)驗(yàn)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)Morris迷宮1981年，英國(guó)心理學(xué)家Morris首次設(shè)計(jì)應(yīng)用了這種水迷宮及其程序。目的是幫助大腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的研究。起初實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要為大鼠，此后該迷宮系統(tǒng)成為評(píng)估嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶能力的經(jīng)典程序，廣泛運(yùn)用于神經(jīng)生物學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中。Morris水迷宮應(yīng)用:判斷動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力組成:觀察指標(biāo):潛伏期，路徑，不同象限的停留時(shí)間和長(zhǎng)度，搜索策略等Morris水迷宮Morris水迷宮原理水是嚙齒類動(dòng)物非常厭惡的刺激或環(huán)境。鼠在水池中就會(huì)急于尋找逃路。它們的習(xí)性為在水池四周尋找出口逃避，但深而光滑的垂直池壁阻礙了這種企圖。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的水下平臺(tái)（用于小鼠的常為水面下1cm）可提供鼠棲身的場(chǎng)所。但在巨大的水面上，強(qiáng)迫游泳的動(dòng)物不能看見平臺(tái)。它們?nèi)粢焖僬业狡脚_(tái)而避免淹沒就必須利用環(huán)境中的線索進(jìn)行定位。從而檢測(cè)了鼠記住環(huán)境中的線索及其與平臺(tái)位置關(guān)系而對(duì)平臺(tái)進(jìn)行定位的能力（學(xué)習(xí)記憶能力）。Morris水迷宮的優(yōu)點(diǎn)由于對(duì)年齡相關(guān)性空間記憶損害有可靠的敏感性，Morris水迷宮是判斷老年小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的特別有用的工具。驅(qū)動(dòng)動(dòng)物逃避的是水刺激，而不需要食物和水的剝奪。因此，避免了剝奪食物和水后給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物帶來的新陳代謝方面的問題。動(dòng)物不必接受電休克，這在那些食欲促進(jìn)任務(wù)（appetitivetasks）如輻射狀迷宮和T迷宮中是常規(guī)的要求。能提供較多的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，系統(tǒng)全面地考察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間認(rèn)知加工的過程，客觀地反映其認(rèn)知水平。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶障礙和感覺、運(yùn)動(dòng)缺陷等分離開來，減少它們對(duì)學(xué)習(xí)記憶過程檢測(cè)的干擾。既可以檢測(cè)空間參考記憶又可以檢測(cè)空間工作記憶。在用固定平臺(tái)測(cè)試小鼠的空間參考記憶后再將平臺(tái)的位置改為不固定，就可檢測(cè)它們的工作記憶能力。顯然，尋找不固定平臺(tái)的認(rèn)知過程要復(fù)雜一些，需要?jiǎng)游飳?duì)時(shí)間和空間上的分離信息加以整合和判斷。操作簡(jiǎn)便，數(shù)據(jù)誤差較小。Morris水迷宮的不足之處由于需要監(jiān)視系統(tǒng)及分析軟件，只有少數(shù)裝備較好的實(shí)驗(yàn)室可以實(shí)施。實(shí)驗(yàn)程序的設(shè)計(jì)需要考慮的因素較多，同時(shí)需要實(shí)驗(yàn)者具備一定的神經(jīng)生理學(xué)、認(rèn)知生理學(xué)和數(shù)理統(tǒng)計(jì)方面的知識(shí)，給實(shí)驗(yàn)的開展和結(jié)果的解釋帶來困難，同時(shí)也限制了該迷宮的深入廣泛的應(yīng)用。由于體力消耗太大，體溫也喪失過多，年老體弱鼠完成任務(wù)較困難。并非所有鼠株都適合于Morris迷宮測(cè)試，如BALB/c不能學(xué)會(huì)該任務(wù)（成績(jī)并不隨天數(shù)的增加而進(jìn)步），129/SvJ的學(xué)習(xí)成績(jī)也偏差。個(gè)體間的成績(jī)差異巨大。某些株，如129/SvJ株的小鼠由于有年齡相關(guān)性視路病變(visualpathology)，在衰老時(shí)完成以視覺為基礎(chǔ)的學(xué)習(xí)記憶任務(wù)時(shí)就會(huì)出現(xiàn)困難。在C57BL/6株，由于嚴(yán)重的禿頭癥（alopecia）存在，可能使某些小鼠產(chǎn)生抑郁，加上潰瘍性皮炎，最終可能影響小鼠的游泳能力而影響實(shí)驗(yàn)成績(jī)。對(duì)輕微的學(xué)習(xí)記憶能力的減退，該迷宮程序可能不敏感。所占實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地過大。LashleyIII水迷宮LashleyIII水迷宮

是一種相對(duì)復(fù)雜的迷宮。它含有動(dòng)物必須學(xué)會(huì)避免的盲端（culs-de-sac）和動(dòng)物必須做出正確的左或右拐彎的T選擇。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5天，每天進(jìn)行2次測(cè)試（上下午各1次）。每天的2次測(cè)試被平均。指標(biāo)包括：學(xué)習(xí)指數(shù)（正確進(jìn)入數(shù)/進(jìn)入總數(shù)）、游向目標(biāo)時(shí)的盲端進(jìn)入數(shù)及T選擇錯(cuò)誤數(shù)、向后進(jìn)入總數(shù)、逃生所用時(shí)間等。八臂放射狀旱迷宮八臂放射狀旱迷宮，是Olten和Samnelson在1976年設(shè)計(jì)的，做為一種評(píng)估大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的方法。它可以同時(shí)評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的工作記憶和參考記憶。原理利用食物作為激勵(lì)措施而到達(dá)目的地，饑餓的動(dòng)物需要實(shí)行特別的搜索順序或利用最短的時(shí)間或最小的錯(cuò)誤來尋求獎(jiǎng)賞。八臂放射狀旱迷宮裝置八臂放射狀旱迷宮是由從中央平臺(tái)伸出的8個(gè)相等的臂呈放射狀排列組成，8臂中有4臂的末端放有食物，在同一天的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中哪些臂中含有食物保持固定不變，但每天之間均有改變。迷宮周圍有若干空間線索。實(shí)驗(yàn)前大鼠需被剝奪食物和水，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，大鼠被放在中央平臺(tái)處后去尋找食物。在實(shí)驗(yàn)中大鼠需記住哪些臂已被探索過，食物已被攝取，以避免再次進(jìn)入，從而在最短的時(shí)間內(nèi)獲得最大量的食物。同時(shí)，在每天的實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠還必須放棄當(dāng)天的記憶信息，以準(zhǔn)備適應(yīng)第二天的實(shí)驗(yàn)。八臂放射狀旱迷宮應(yīng)用評(píng)估動(dòng)物工作記憶和參考記憶

工作記憶是指利用一個(gè)僅僅在短時(shí)間內(nèi)的保留信息，或稱為實(shí)驗(yàn)特定信息（trial-specificinformation）而獲得的記憶，它是對(duì)實(shí)驗(yàn)中可變事物的記憶能力。

參考記憶是對(duì)持續(xù)存在的信息，或稱為任務(wù)特定信息（task-specificinformation）的記憶，它是對(duì)實(shí)驗(yàn)中不變事物的記憶能力。八臂放射狀旱迷宮觀察指標(biāo)時(shí)間測(cè)定和錯(cuò)誤積分存在的問題優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的工作記憶和參考記憶不足：氣味的影響。包括食物的氣味、其他動(dòng)物的氣味以及動(dòng)物自身的氣味。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被限制食物和水，由此會(huì)帶來的影響。并且不同的食物獎(jiǎng)賞也可產(chǎn)生明顯的影響；另外，動(dòng)物種屬的不同使其在食物需求上也可導(dǎo)致不同的結(jié)論。穿梭箱實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)裝置實(shí)驗(yàn)箱大小為50cm×16cm×18cm。箱底部格柵為可以通電的不銹鋼棒，箱底中央部有一高1.2cm的擋板，將箱底部分隔成左右兩列。實(shí)驗(yàn)箱頂部有光源，蜂鳴音控制器。訓(xùn)練時(shí)，將大白鼠放入箱內(nèi)任何一側(cè)，20s后開始呈現(xiàn)燈光和（或）蜂鳴音，持續(xù)15s，后10s內(nèi)同時(shí)給以電刺激(100V，O.2mA，50Hz，AC)。最初，動(dòng)物只對(duì)電擊有反應(yīng)，即逃至對(duì)側(cè)以回避電擊。20s后再次出現(xiàn)條件刺激并繼之在動(dòng)物所在側(cè)施以電刺激，迫使動(dòng)物跳至另一側(cè)……如此來往穿梭。當(dāng)蜂鳴音或／燈光信號(hào)呈現(xiàn)時(shí)，大白鼠立即逃至對(duì)側(cè)安全區(qū)以躲避電擊，即認(rèn)為出現(xiàn)了條件反應(yīng)(或稱主動(dòng)回避反應(yīng))。每閑天訓(xùn)練一回，每回100次。約訓(xùn)練4—5回后．動(dòng)物的主動(dòng)回避反應(yīng)率可達(dá)80％～90％。此法可同時(shí)觀察被動(dòng)和主動(dòng)回避性反應(yīng).此外．從動(dòng)物的反應(yīng)次數(shù)也可以了解動(dòng)物系處于興奮或抑制狀態(tài)。穿梭箱實(shí)驗(yàn)自動(dòng)記錄系統(tǒng)可以輸出以下內(nèi)容：(1)動(dòng)物序號(hào)；(2)遭受刺激次數(shù)；(3)遭受刺激時(shí)間；(4)主動(dòng)回避反應(yīng)時(shí)間。以上各值均為在設(shè)定的穿梭次數(shù)內(nèi)反應(yīng)的總和。遭受電激次數(shù)是被動(dòng)回避的次數(shù)，該值與設(shè)定循環(huán)次數(shù)之差即為主動(dòng)回避次數(shù)；刺激時(shí)間是指動(dòng)物在被動(dòng)回避過程受到電刺激的時(shí)間和，該值愈小，說明動(dòng)物被動(dòng)反應(yīng)愈敏捷，主動(dòng)回避時(shí)間是指動(dòng)物在接受條件刺激的時(shí)間長(zhǎng)短，該值越短，說明動(dòng)物主動(dòng)回避反應(yīng)越迅速．跳臺(tái)試驗(yàn)

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)屬一次性刺激回避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)（ONETRAILAVOIDANCETEST）。裝置：試驗(yàn)裝置為一長(zhǎng)方形反射箱，大小為10cm×10cm×60cm，用黑色塑板分割成5間。地面鋪以柵欄，間距0.5cm，可以通電，每間角落置一高和直徑均為4.5cm的平臺(tái)。跳臺(tái)試驗(yàn)原理

在一個(gè)開闊的空間，動(dòng)物大部分時(shí)間都在邊緣及角落里活動(dòng)。在一個(gè)方形中心設(shè)置一個(gè)高的平臺(tái)，當(dāng)把動(dòng)物放在平臺(tái)時(shí)，它幾乎立即跳下平臺(tái)并向四周探索接近邊緣指標(biāo)潛伏期：記錄動(dòng)物從上平臺(tái)到第一次下平臺(tái)的時(shí)間操作步驟一個(gè)典型的例子包含三個(gè)過程：熟悉過程

學(xué)習(xí)過程

記憶檢測(cè)熟悉過程：將動(dòng)物放在平臺(tái)上，開始計(jì)時(shí)，至動(dòng)物跳下。此時(shí)間段為潛伏期。動(dòng)物探索10s以后，放回籠中學(xué)習(xí)過程：動(dòng)物一旦從平臺(tái)上跳下后，立即受到電刺激，然后放回籠中記憶檢測(cè)：學(xué)習(xí)試驗(yàn)24h后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重新放回平臺(tái)上，記錄跳下平臺(tái)的潛伏期。動(dòng)物跳下平臺(tái)或持續(xù)停留在平臺(tái)上標(biāo)志著驗(yàn)的結(jié)束（終止時(shí)間為60s）。將動(dòng)物放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3min，然后立即通以36V交流電。動(dòng)物受到電擊，其正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)以躲避傷害性刺激。多數(shù)動(dòng)物可能再次或多次跳至柵欄上，受到電擊后又迅速跳回平臺(tái)。如此訓(xùn)練5min，并記錄每鼠受到電擊的次數(shù)或叫錯(cuò)誤次數(shù)（numberoferrors），以此作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24h后重做測(cè)試，此即叫記憶保持測(cè)試。記錄受電擊死亡動(dòng)物數(shù)、第一次跳下平臺(tái)的潛伏期和3min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)。三、電生理學(xué)方法

電生理學(xué)的方法包括胞外記錄、胞內(nèi)記錄、腦內(nèi)電刺激、電壓鉗、膜片鉗、腦電圖等技術(shù)。1、電生理常用儀器

陰極射線示波器:高靈敏度，掃描速度慢

生物電放大器

電子刺激器

貯存和分析電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果的儀器：如示波器照相機(jī)和計(jì)算機(jī)。2、電生理學(xué)的常用方法

細(xì)胞外記錄(Extracellularrecording)：把引導(dǎo)電極安放在神經(jīng)組織的表面或附近引導(dǎo)神經(jīng)組織的電活動(dòng)。胞內(nèi)記錄(Intracellularrecording)：研究神經(jīng)元基本生物物理特性的有力手段。EPSP,IPSP,AP(動(dòng)作電位)腦內(nèi)電刺激：是研究中樞功能定位的方法之一。

順行沖動(dòng)記錄法(Orthodromicimpulserecording)：就是電刺激某一突觸前的細(xì)胞體、樹突或軸突，在此突觸后神經(jīng)元細(xì)胞體上記錄此刺激引起的電活動(dòng)變化。逆行沖動(dòng)記錄法(Antidromicimpulserecording)：逆行沖動(dòng)記錄法即電刺激神經(jīng)元的軸突主干或末梢，在同一神經(jīng)元胞體記錄反相傳導(dǎo)的動(dòng)作電位。

電壓鉗技術(shù)(VoltageClamp)：通過插入細(xì)胞內(nèi)的一根微電極向細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)充電流，補(bǔ)充的電流量正好等于跨膜流出的反向離子流，這樣即使膜通透性發(fā)生改變時(shí)，也能控制膜電位數(shù)值的不變。經(jīng)過離子通道的離子流與經(jīng)微電極施加的電流方向相反，數(shù)量相等。

SG:信號(hào)發(fā)生器，F(xiàn)BA:反饋放大器，V監(jiān)測(cè)膜電位膜(斑)片鉗技術(shù)（PatchClamp）：可以從分子水平研究細(xì)胞膜離子通道的功能，是用玻璃微電極吸管和只含１～３個(gè)離子通道，面積為幾個(gè)平方微米的細(xì)胞膜通過負(fù)壓吸引封接起來，由于電極尖端與細(xì)胞膜的高阻封接，此片膜內(nèi)開放所產(chǎn)生的電流流進(jìn)玻璃吸管，用一極敏感的電流監(jiān)視器（斑片鉗放大器）測(cè)量此電流強(qiáng)度，就代表單一離子通道電流。膜片鉗（patchclamp）

內(nèi)爾(Neher)薩克曼(Sakmann)

（1944-）（1942-）（德國(guó)細(xì)胞生理學(xué)家）（德國(guó)細(xì)胞生理學(xué)家）

合作發(fā)明了膜片箝技術(shù)，并應(yīng)用這一技術(shù)首次證實(shí)了細(xì)胞膜上存在離子通道。這一成果對(duì)于研究細(xì)胞功能的調(diào)控至關(guān)重要，可揭示神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及糖尿病等多種疾病的發(fā)病機(jī)理，并提供治療的新途徑。二人共獲1991年諾貝爾獎(jiǎng)。膜片鉗經(jīng)典記錄模式：貼附式（Cell-attached或oncell)

內(nèi)膜向外式(Inside-out)

外膜向外式(Outside-out)

全細(xì)胞記錄方式(Whole-cellrecording)

腦電波測(cè)定:

用雙極或單極引導(dǎo)法，將引導(dǎo)電極放在腦活動(dòng)區(qū)顱骨表面之上，可以記錄出能變換方向的微弱電流。通過強(qiáng)力放大記錄出來的電位稱腦電圖（ＥＥＧ）。

誘發(fā)電位:

中樞神經(jīng)的任何部位對(duì)于故意刺激感受器官，感受神經(jīng)、感覺通路上的任何一點(diǎn)，或與感覺器官有關(guān)的任何結(jié)構(gòu)上的一點(diǎn)，所產(chǎn)生的電變化，叫做誘發(fā)電位（evokedpotential)。

經(jīng)典的生物化學(xué)方法包括：離心電泳層析質(zhì)譜等由于生物化學(xué)方法與藥理學(xué)、免疫學(xué)等其他學(xué)科相結(jié)合，又發(fā)展了：放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)放射受體免疫印跡等方面四、生物化學(xué)方法

1、用離心法分離制備突觸小體及突出小體膜突觸小體:是指腦組織在等滲溶液中勻漿時(shí)，神經(jīng)末梢的細(xì)胞膜從軸突上自發(fā)斷裂、封閉而形成的神經(jīng)末梢單位。它包括突觸前膜、突觸后膜及致密斑和包圍在突觸前膜的突觸小泡(vesicle內(nèi)含神經(jīng)遞質(zhì))，線粒體及胞漿蛋白質(zhì)。由于突觸小體是神經(jīng)介質(zhì)及受體的主要聚集部位，突觸小體的制備便成了神經(jīng)介質(zhì)及受體的基本制備手段。

離心（centrifuge）離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。離心離心機(jī)種類制備型離心機(jī)

普通：（6000rpm以下）高速冷凍（25000rpm以下）超速（可達(dá)50000～80000rpm）分析型離心機(jī)離心制備型離心方法差速沉降離心法

密度梯度區(qū)帶離心法（簡(jiǎn)稱區(qū)帶離心法）

2、層析法:

特點(diǎn)：分離生物活性物質(zhì)時(shí)不使其失活，可大量制備?；驹恚罕环蛛x物質(zhì)與支持物相互作用的緊密程度不同，流洗時(shí)被洗脫的難易程度不同。

常用層析方法離子交換層析凝膠過濾層析親和層析疏水層析高效液相離子交換層析凝膠過濾層析親和層析3、放射免疫(radioimmunoassay,RIA)測(cè)定神經(jīng)介質(zhì)：利用抗體(Ab)特異地識(shí)別其抗原（Ag）的原理，將抗原標(biāo)記放射性同位素（*Ag），用來測(cè)定與*Ag抗原性相同的物質(zhì)。

4、放射受體測(cè)定受體法：

利用標(biāo)記能作用于不同靶組織內(nèi)各種受體的遞質(zhì)和激素，從而達(dá)到直接測(cè)定配體與其受體形成絡(luò)合物的過程和理化特性。5、免疫印跡法（immunoblotting或westernblotting）鑒定生物分子：是將電泳凝膠分離出來的電泳帶移到特殊的濾膜上，再利用標(biāo)記抗體與濾膜上某一蛋白質(zhì)或肽的特異結(jié)合，使其顯色。優(yōu)點(diǎn)：一是將傳統(tǒng)的電泳凝膠染色法的敏感度提高了100~1000倍，二是RIA與相似，能從多種蛋白質(zhì)中選擇鑒定出一種特異的蛋白質(zhì)，其敏感性可達(dá)1ng，同時(shí)又能知道這一蛋白質(zhì)的分子量，這又是RIA無法達(dá)到的。6.電泳電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。電泳技術(shù)有很多種方法，介紹最常用的兩種：水平板式電泳槽垂直板式電泳槽穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀蛋白質(zhì)SDS電泳染色結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。

瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定核酸:如重組質(zhì)粒的鑒定，DNA酶譜制作等。瓊脂糖濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度/%線狀DNA大小/kb0.5

0.7

1.0

1.2

1.5

2.030-1

12-0.8

10-0.57-0.4

3-0.2

2-0.05凝膠的制備與電泳樣品配制與加樣染色和拍照五、分子生物學(xué)方法

１、神經(jīng)生物學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)方法基因的分子克隆克隆后的基因在人工體外表達(dá)系統(tǒng)或細(xì)胞中的表達(dá)克隆后的基因作為探針研究基因表達(dá)的組織特異性和發(fā)育階段特異性研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的結(jié)構(gòu)特征有助于理解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制

2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：在神經(jīng)生物學(xué)研究中有廣泛的用途，如可應(yīng)用它發(fā)現(xiàn)和分析新基因，測(cè)定mRNA

３、反向遺傳學(xué)利用制造體內(nèi)基因突變的方法研究基因及其產(chǎn)物的功能：通過制造定向突變改變生物表型的方法與傳統(tǒng)遺傳學(xué)所采用的通過生物表型確定其基因型的方法相反，故稱反向遺傳學(xué)。

４、遺傳連鎖分析法分離遺傳病基因：人類基因組由23條染色體組成，基因組內(nèi)大約包含5~10萬個(gè)基因，其中40%在腦內(nèi)表達(dá)。約有1000多種遺傳病具有明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，占已知遺傳病總數(shù)的三分之一。

六、腦成像（