第九章-病毒感染與細(xì)胞凋亡

病毒學(xué)第九章病毒感染與細(xì)胞凋亡第九章病毒感染與細(xì)胞凋亡第一節(jié)

細(xì)胞凋亡第二節(jié)病毒感染與細(xì)胞凋亡的相互關(guān)系第三節(jié)桿狀病毒與細(xì)胞凋亡第四節(jié)流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡第五節(jié)病毒性肝炎與細(xì)胞凋亡第一節(jié)

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）細(xì)胞凋亡的含義細(xì)胞凋亡的重要性凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制凋亡對病毒復(fù)制策略的影響

1972年Kerr等已發(fā)現(xiàn)從細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和生化變化等方面來分析，認(rèn)為細(xì)胞有二種死亡形式：細(xì)胞壞死(Necrosis)程序性細(xì)胞死亡（Programmedcelldeath,PCD）現(xiàn)在普遍稱之為細(xì)胞凋亡（Apoptosis）。細(xì)胞凋亡：一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程。一、細(xì)胞凋亡的含義細(xì)胞凋亡的生理意義：

確保正常發(fā)育、生長

維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定

發(fā)揮積極的防御功能二、細(xì)胞凋亡的重要性三、凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制在分子水平上，凋亡過程可分為兩個階段：信號傳遞階段死亡信號的探測、信號向下游死亡機(jī)制的傳遞。胞外信號：配體與受體的特異結(jié)合；胞內(nèi)信號：毒素、射線引起的損傷或病毒感染。效應(yīng)階段（共同的）—Caspase（半胱氨酸蛋白酶）三條信號通路：膜死亡信號通路（配體-受體相互作用）線粒體信號通路（主要與Bcl-2家族蛋白有關(guān)）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的信號通路（Bcl-2家族蛋白起重要作用）兩大蛋白：

Caspase（半胱氨酸蛋白酶）Bcl-2膜死亡信號通路（以Fas-FasL為例）

FASL+FAS→+FADD↓

凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物（DISC）↓胞質(zhì)中游離的caspase8聚集到這個復(fù)合物上↓細(xì)胞有足夠活化的caspase8↓死亡受體活化，切割Bid，tBid到線粒體

Ctyc釋放到胞質(zhì)↓

→→→→細(xì)胞凋亡線粒體參與細(xì)胞凋亡或壞死的途徑釋放caspase活化因子：Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子細(xì)胞色素C：細(xì)胞色素C+Apaf-1+caspase9—凋亡體AIF（凋亡誘導(dǎo)因子-激活核酸內(nèi)切酶）Smac/DiabloHtrA2阻斷IAP參與凋亡凋控Procaspase3線粒體信號通路凋亡啟動因子細(xì)胞凋亡的兩條通路：膜受體通路、線粒體通路凋亡過程可大致分成4個階段凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡基因激活凋亡的執(zhí)行凋亡細(xì)胞的清除凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點(diǎn)①多樣性：不同種類細(xì)胞有不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)②偶聯(lián)性：死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與細(xì)胞增殖、分化過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在一些環(huán)節(jié)上交叉、偶聯(lián)③同一性：不同凋亡誘導(dǎo)因素可通過同一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)引起細(xì)胞凋亡④多途性：同一凋亡誘導(dǎo)因素可經(jīng)過多條信號途徑觸發(fā)細(xì)胞凋亡有些胞內(nèi)寄生病毒在進(jìn)化過程中，獲得了抑制其感染細(xì)胞凋亡的能力。其抑制機(jī)理主要有兩個方面感染時誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生熱休克蛋白，從而干擾細(xì)胞凋亡途徑,HSP是機(jī)體受到應(yīng)激原的刺激后產(chǎn)生的具有高度保守性的蛋白家族，對維持細(xì)胞生存和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用；激活抗凋亡分子；病毒既能促進(jìn)，也能抑制宿主細(xì)胞的凋亡。四、凋亡對病毒復(fù)制策略的影響病毒誘導(dǎo)凋亡機(jī)制：細(xì)胞周期失調(diào)、單個基因過量表達(dá)；病毒抑制凋亡機(jī)制：

腺病毒：E1A、E1B（19K/55K）、E3；

SV40：T抗原；

乳頭瘤病毒：E6；

痘病毒：crmA

EB病毒：BHRF1（Bcl-2同源基因）

人皰疹病毒8型：KS（Bcl-2同源基因）一、病毒的復(fù)制周期二、病毒感染與細(xì)胞凋亡的關(guān)系三、細(xì)胞凋亡與臨床病毒的密切關(guān)系第二節(jié)病毒感染與細(xì)胞凋亡的相互關(guān)系吸附、脫殼→將本身的遺傳物質(zhì)進(jìn)入活的宿主細(xì)胞→利用宿主細(xì)胞提供的低分子物質(zhì)及酶系首先合成一些抑制蛋白和病毒復(fù)制必須的復(fù)制酶→大量合成病毒核酸和結(jié)構(gòu)蛋白→組裝成熟的病毒→釋放在整個復(fù)制周期中，病毒先表達(dá)一些蛋白來維持宿主細(xì)胞的存活，為其復(fù)制提供合成原料；當(dāng)其成熟之后，又誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡并釋放出來，再感染新的活性細(xì)胞，開始另一個復(fù)制周期。一、病毒的復(fù)制周期宿主免疫細(xì)胞利用細(xì)胞凋亡來清除病毒感染細(xì)胞；病毒可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡在遭到病毒攻擊時，細(xì)胞通過自殺，可以阻止或限制病毒的復(fù)制。而作為打破宿主防御體系的一種策略，不少病毒自身基因組編碼有抗細(xì)胞凋亡的基因，使之能獲得最大的生長優(yōu)勢,以利于生存與繁衍。目前已經(jīng)在腺病毒科、皰疹病毒科和桿狀病毒科中發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基因。病毒對宿主凋亡行為的控制能力影響病毒對特定宿主的致病力（宿主范圍、組織特異性、持續(xù)性和潛伏性）。二、病毒感染與細(xì)胞凋亡的關(guān)系病毒感染是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要因素,病毒感染后不僅可通過自身基因的表達(dá)激活或抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生,也可與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因一起共同參與凋亡的調(diào)控。病毒感染促進(jìn)細(xì)胞凋亡在感染晚期病毒誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這是病毒擴(kuò)散并感染鄰近細(xì)胞的重要步驟。病毒感染抑制細(xì)胞凋亡機(jī)體受到病毒感染后，為維持正常的生理活動，盡可能減少病毒的損害，會誘發(fā)機(jī)體自身控制的凋亡基因的啟動表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如：①丙型肝炎病毒（HCV）的核心蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，細(xì)胞傾向于Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。（一）病毒感染促進(jìn)細(xì)胞凋亡②HIV感染的細(xì)胞中，HIVgp120蛋白是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要原因，gp120產(chǎn)生異常信號并傳遞給免疫感受態(tài)細(xì)胞以增加凋亡，其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，CD4+T細(xì)胞被誘導(dǎo)增快凋亡。在HIV感染的個體中Fas受體的表達(dá)增加，伴隨淋巴細(xì)胞對抗Fas抗體敏感性提高。

③呼腸孤病毒（reovirus）不同型誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力不同。誘導(dǎo)凋亡的不同能力是由病毒的S1和M2基因所決定的。④其他病毒：痘苗病毒、SV40、HSV等感染也可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。（二）病毒感染抑制細(xì)胞凋亡

ICE家族在控制脊椎動物細(xì)胞凋亡中起著重要作用：

SV40的T抗原與ICE家族作用可抑制凋亡;T抗原可結(jié)合到p53基因的DNA結(jié)合區(qū)，阻斷其特異性的啟動元件，抑制P53依賴的細(xì)胞凋亡；

桿狀病毒的P35蛋白、牛痘病毒的CrmA為ICE/Ced-3家族成員的活性抑制劑。

原癌基因Bcl-2等的表達(dá)直接影響細(xì)胞凋亡：

EB病毒的基因產(chǎn)物BHRF1是Bcl-2的類似物，是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡的抑制劑，卡波氏肉瘤病毒和人皰疹病毒8型也編碼Bcl-2類似物。三、細(xì)胞凋亡與臨床病毒的密切關(guān)系在健康的機(jī)體中，細(xì)胞的生生死死總是處于一個良性的動態(tài)平衡中，如果這種平衡被破壞，人就會患病。如果該死亡的細(xì)胞沒有死亡，就可以導(dǎo)致細(xì)胞惡性增長，形成癌癥。如果不該死亡的細(xì)胞過多地死亡，如：受艾滋病病毒的攻擊，不該死亡的淋巴細(xì)胞大批死亡，就會破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致艾滋病發(fā)作。細(xì)胞凋亡與疾病的關(guān)系——

該“死”的細(xì)胞不死，不該“死”的細(xì)胞卻死了，也就是說無論凋亡過度或凋亡不足都可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生。細(xì)胞凋亡不足：腫瘤、病毒感染細(xì)胞凋亡過度：心肌缺血、心力衰竭、神經(jīng)元退行性疾病、病毒感染不足與過度并存：動脈粥樣硬化病毒感染宿主細(xì)胞后有兩種結(jié)局：

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而限制病毒生長（肝炎病毒）；由病毒基因表達(dá)的蛋白抑制宿主細(xì)胞凋亡，造成持續(xù)性感染或增加某些病毒的致癌可能性。AIDS:由HIV感染引起，其關(guān)鍵是CD4+T淋巴細(xì)胞被破壞，導(dǎo)致CD4+淋巴細(xì)胞顯著減少，相關(guān)免疫功能缺陷。HIV病毒感染造成CD4+T細(xì)胞減少是通過細(xì)胞凋亡機(jī)制

HIV感染引起愛滋病，主要發(fā)病機(jī)制是HIV感染后特異性地破壞CD4+細(xì)胞，使CD4+以及與其相關(guān)的免疫功能缺陷，易招致機(jī)會性感染及腫瘤。CD4+T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)顯著減少的原因，主要是通過細(xì)胞凋亡機(jī)制造成的。合胞體形成：受HIV感染的CD4+細(xì)胞表面有g(shù)p120表達(dá)，它可以和未受感染的CD4+細(xì)胞形成融合的多核細(xì)胞(合胞體)，因而改變了細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞溶解和破壞。

Fas基因表達(dá)上調(diào)HIV基因產(chǎn)物GP120能直接啟動CD4+淋巴細(xì)胞的死亡程序T細(xì)胞激活正常的T細(xì)胞功能對于維持免疫系統(tǒng)內(nèi)外的穩(wěn)態(tài)是必需的，激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。細(xì)胞因子受感染的Mφ釋放TNF增多HIV感染導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡的相關(guān)因素第三節(jié)桿狀病毒與細(xì)胞凋亡桿狀病毒感染后引起細(xì)胞凋亡：桿狀病毒是最早發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控宿主行為能力的病毒之一桿狀病毒在進(jìn)化過程中為適應(yīng)自身的生活環(huán)境及繁殖的需要，獲得了一些進(jìn)化上的生長優(yōu)勢，通過作用于宿主細(xì)胞凋亡途徑中保守部位，在細(xì)胞水平上對宿主細(xì)胞的壽命進(jìn)行調(diào)控。桿狀病毒感染后引起細(xì)胞凋亡：桿狀病毒的抗細(xì)胞凋亡基因

目前已知桿狀病毒編碼兩種阻遏宿主細(xì)胞因病毒感染而誘發(fā)細(xì)胞凋亡的抗細(xì)胞凋亡基因（inhibitorofapotosis），分別為iap基因和p35基因。iap（inhibitorofapoptosis）基因是p35基因缺陷型的AcMNPV病毒與蘋果小卷蛾顆粒體病毒（Cydiapomonellagranulosisvirus,CpGV）及黃杉毒蛾（Orgyiapseudotsugata）NPV基因文庫在Sf細(xì)胞中進(jìn)行功能互補(bǔ)試驗時發(fā)現(xiàn)的。Cp-IAP和Op-IAP的氨基酸序列與AcMNPV的P35的氨基酸序列無明顯的同源性。IAP家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征IAP蛋白的抗細(xì)胞凋亡功能及其作用機(jī)理P35蛋白的抗細(xì)胞凋亡功能及其作用機(jī)理桿狀病毒IAP重復(fù)：Ｎ末端由70aa.組成的重復(fù)序列（baculoviralIAPrepeat，簡稱BIR），已知含IAP家族蛋白的病毒和動物的IAP蛋白最多可含有三個BIR結(jié)構(gòu)，不同來源的IAP蛋白，組氨酸和半胱氨酸殘基在BIR結(jié)構(gòu)域中具有相似的位置；環(huán)鋅指結(jié)構(gòu)：IAP蛋白還具有一個保守的鋅結(jié)合區(qū)域，（ringzinc-finger,RZF），位于IAP蛋白的C末端。

IAP蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)及BIR序列是抑制細(xì)胞凋亡的必需元件。IAP家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征IAP蛋白C末端有RZF，因此IAP蛋白是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。桿狀病毒的IAPs也能在其他類型的細(xì)胞中抑制細(xì)胞凋亡：Op-IAP可部分阻遏Caspase-1或FADD過量表達(dá)誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡；Cp-IAP能部分阻遏Reaper在果蠅正在發(fā)育的眼中的過量表達(dá)引起的細(xì)胞凋亡；桿狀病毒的感染能激活Sf-Caspase-1的形成，IAPs則能夠有效阻止Caspase-1前體的激活。IAP蛋白的抗細(xì)胞凋亡功能及其作用機(jī)理與桿狀病毒的IAPs相似，哺乳動物的IAPs也能阻止不同刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。抑制細(xì)胞凋亡至少需要一個BIR結(jié)構(gòu)域存在，有的研究發(fā)現(xiàn)桿狀病毒IAP蛋白需要N末端的BIR結(jié)構(gòu)和C末端的環(huán)鋅指結(jié)構(gòu)同時存在，才能抑制細(xì)胞凋亡。也有研究表明Op-IAP只需BIR2的存在就足以抑制由果蠅促細(xì)胞凋亡蛋白HID誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡作為宿主抵御病毒侵染的一個重要防御機(jī)制，它不僅可以有效地削弱桿狀病毒的復(fù)制，還可以降低病毒的感染力。與此相對，病毒自身基因則編碼抗細(xì)胞凋亡因子，以獲得最大的生長優(yōu)勢。有研究發(fā)現(xiàn)，在Sf-9和Tn-5B1-4等幾種昆蟲細(xì)胞的基因組中，都發(fā)現(xiàn)有與抗細(xì)胞凋亡的基因P35同源性很高的片段。這說明在宿主細(xì)胞中可能存在抗細(xì)胞凋亡的基因。P35蛋白的抗細(xì)胞凋亡功能及其作用機(jī)理P35蛋白的抗細(xì)胞凋亡功能及其作用機(jī)理

p35基因首先發(fā)現(xiàn)于AcMNPV，隨后又在BmNPV中發(fā)現(xiàn)。桿狀病毒p35基因的表達(dá)產(chǎn)物能抑制病毒感染而引起的細(xì)胞凋亡。如AcMNPV能有效地阻止caspase過量表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。桿狀病毒p35基因還能抑制線蟲和果蠅的發(fā)育細(xì)胞死亡，以及由于血清或NGF喪失而誘導(dǎo)的哺乳動物的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。桿狀病毒的P35蛋白通過直接抑制Caspase來阻止病毒感染的昆蟲細(xì)胞發(fā)生凋亡，P35對Caspase家族成員高度專一。

P35最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)決定簇是環(huán)狀區(qū)域，即Caspase剪切位點(diǎn)周圍的殘基。環(huán)的變化可能通過改變環(huán)與Caspase活性位點(diǎn)的相互作用提供或取消抑制功能，或是改變特異性。P35能阻遏激活形式的Caspase誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。IAPs抗細(xì)胞凋亡的途徑與P35不同，它是阻止了執(zhí)行型Caspase的活化，而P35幾乎是所有Caspase的拮抗物。從這點(diǎn)意義上來說，在抑制細(xì)胞死亡的途徑中，P35是在與IAP等位置處或是抑制上游Caspase。第四節(jié)流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡TakizawaT(1993)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)Hela細(xì)胞在感染人甲型流感病毒之后，細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、凝聚、凋亡小體形成、提取DNA進(jìn)行電泳呈典型“階梯狀”條帶等一系列凋亡特有的變化，故首次提出：流感病毒可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生凋亡。目前，關(guān)于流感病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制有以下幾種看法，認(rèn)為與其相關(guān)的物質(zhì)有：Fas(屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子受體超家族)NA（神經(jīng)氨酸酶）TGF-β（轉(zhuǎn)化生長因子β）PKR(double-strandedRNA-activatedproteinKinase）:干擾素誘生的雙鏈RNA活化的蛋白激酶NS(nonstructural）:只在感染細(xì)胞中出現(xiàn)PB1-F2:

第11種病毒蛋白PB1-F是在H1N1亞型中發(fā)現(xiàn)的(位于宿主細(xì)胞的線粒體上)一、流感病毒誘導(dǎo)Fas基因和Fas分子N端的死亡信號激發(fā)域表達(dá)1993年TakizawaT等在用流感病毒感染體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，在感染的早期階段可誘導(dǎo)Fas表達(dá)于細(xì)胞表面，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。1997年Matsumura等提出流感病毒感染Hela細(xì)胞后，在凋亡發(fā)生以前細(xì)胞表面Fas以及FasL的數(shù)量增加，而且加入抗FasL的抗體后凋亡可被抑制。二、流感病毒通過其表面的NA激活TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡TGF-β可誘導(dǎo)非腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞；誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在馬流感病毒感染MDCK細(xì)胞過程中，TGF-β增加，從而激發(fā)JNK／SAPK信號途徑；用流感病毒感染小鼠，1天后具有活性的TGF-β水平增高。進(jìn)一步研究顯示，NA糖蛋白可激活潛在的TGF-β，從而引起細(xì)胞發(fā)生凋亡(不是唯一途徑)。三、PKR(雙鏈RNA活化的蛋白激酶)與細(xì)胞凋亡PKR是由干擾素誘生的雙鏈RNA活化的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，與病毒的發(fā)病機(jī)制、細(xì)胞生長及凋亡有密切關(guān)系在流感病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中，PKR能調(diào)控幾條重要的細(xì)胞信號途徑因而具有重要的效應(yīng)，其中較為重要的一個就是能夠增加干擾素的數(shù)量及活性；PKR活化可以誘導(dǎo)TNFR家族成員包括Fas和前凋亡因子Bax的表達(dá)，且在PKR活化過程中，F(xiàn)asmRNA表達(dá)上調(diào)。四、NS與細(xì)胞凋亡流感病毒NS(nonstructura1)基因是其內(nèi)部基因組中最小的基因節(jié)段，它轉(zhuǎn)錄成的共線性mRNA共編碼兩種蛋白即NS1和NS2蛋白。這兩種蛋白僅在被流感病毒感染的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，而在病毒體中未能