《日化產品除菌效果的評價方法》

1QB/TXXXX—XXXX日化產品除菌效果的評價方法本方法描述了具有除菌功能的織物洗滌劑和肌膚清潔產品的除菌效果的評價方法。本文件第一法適用于織物洗滌劑的除菌效果評價，第二法適用于肌膚清潔產品的除菌效果評價。本文件不適用于配方中添加微生物的產品。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.2食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T25812染料試驗用標準漂白棉布QB/T2738—2023日化產品抗菌抑菌效果的評價方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1除菌eliminatingbacterial采用物理化學方法洗去載體表面上附著的細菌/真菌的過程。3.2載體carrier試驗微生物的支持物。），3.3菌落形成單位colonyformingunit；CFU在活菌培養(yǎng)計數(shù)時，由單個菌落或聚集成團的多個菌體在固體培養(yǎng)基上生長繁殖所形成的集落。），3.4織物洗滌劑fabricdetergent用于織物的洗滌產品。3.5肌膚清潔產品skincleansingproducts用于人體肌膚清潔類的產品。2QB/TXXXX－XXXX4生物安全及無菌操作的基本要求實驗環(huán)境應滿足GB19489的相關規(guī)定，由經過專業(yè)培訓的人員進行試驗。無菌操作的基本要求參考QB/T2738—2023第4章。5第一法織物洗滌劑除菌效果評價方法5.1原理將試驗微生物懸浮液涂覆到載體上，模擬實際洗滌過程用待測試樣處理染菌載體，再通過無菌操作回收載體表面殘留活菌。同時用無菌硬水處理染菌載體作為空白對照，用于試驗有效性評價指標，并對染菌載體進行基線回收，用于評價待測試樣的除菌效果。5.2儀器與設備5.2.1高壓蒸汽滅菌鍋。5.2.2恒溫培養(yǎng)箱：控溫精度±1℃。5.2.3恒溫磁力攪拌器：配圓柱帶節(jié)型攪拌轉子，8mm×35mm。5.2.4分析天平：精度為0.01g、0.001g。5.2.5試管：?18mm×180mm。5.2.6移液器：20μL，1mL，5mL，10mL。5.2.7培養(yǎng)皿：?90mm。5.2.8錐形瓶：500mL。5.2.9廣口玻璃瓶：400mL，瓶口寬60mm~70mm，帶塞子。5.2.10渦旋震蕩器。5.2.11鑷子。5.2.12醫(yī)用無菌采樣杯：60mL。5.2.13濁度儀。5.2.14生物安全柜5.2.15恒溫水浴鍋：控溫精度±1℃5.3試劑5.3.1培養(yǎng)基商品化的合格市售培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、營養(yǎng)肉湯（NB）。5.3.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）稱取2.83g磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、1.36g磷酸二氫鉀（KH2PO4），加蒸餾水1000mL，待完全溶解后，調pH至7.2~7.4，經121℃壓力蒸汽滅菌20min后備用。5.3.3硬水（硬度342mg/L）稱取0.304g氯化鈣（CaCl2）、0.139g氯化鎂（MgCl2?6H2O加蒸餾水1000mL，即為342mg/L硬水。經121℃壓力蒸汽滅菌20min后備用。5.3.4洗脫液稱取3.0g大豆卵磷脂、10.0g吐溫80，加入0.03mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）1000mL，溶解后攪拌均勻，經121℃壓力蒸汽滅菌20min后備用。5.4評價原則5.4.1織物洗滌劑作用濃度與測試菌種的選擇一般情況按產品說明中標識的除菌作用濃度和試驗菌種進行。如產品說明未標識可參考表1進行，也可根據產品的使用要求增加其他菌種作為檢驗菌種。3QB/TXXXX—XXXX表1織物洗滌劑作用濃度與試驗菌種的選擇肺炎克雷伯菌（ATCC4352）5.4.2菌落計數(shù)按GB4789.2中規(guī)定計數(shù)。5.5操作步驟5.5.1菌懸液的準備取菌種3代~5代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物，參照QB/T2738—2023中7.2.2.5制備菌懸液，用0.03mol/LPBS溶液將試驗菌懸液稀釋，通過濁度儀調節(jié)菌懸液濃度至1.0×108CFU/mL～9.0×108CFU/mL備用。5.5.2測試載體的前處理以符合GB/T25812規(guī)定的純棉白布作為測試載體，參照QB/T2738—2023中7.4.4.1脫脂處理后裁剪成3cm×3cm的方布片，121℃滅菌20min45±1）℃烘干備用。5.5.3染菌載體的制備每片3cm×3cm布片平鋪于培養(yǎng)皿內，各接種20μL菌懸液使其均勻擴散到布片上，蓋上蓋子于（36±1）℃的培養(yǎng)箱中干燥固定20min，取出放入生物安全柜備用（染菌載體應4h內使用）。5.5.4基線回收每3片5.5.3制備好的染菌載體為一組，將1組染菌載體逐片放入含30mL洗脫液的醫(yī)用無菌采樣杯中，在渦旋震蕩器上混合60s進行基線回收。5.5.5試驗組的處理5.5.5.1洗滌試驗在400mL廣口玻璃瓶內進行，試驗時用250mL的硬水將待測洗滌產品稀釋至產品標明的除菌作用濃度，或參考表1執(zhí)行。注意洗滌溶液的水溫控制在（30±1）℃,將配制好的洗滌溶液放于磁力攪拌器上混勻至少10min。5.5.5.2將一組5.5.3制備好的染菌載體逐片放入廣口玻璃瓶內，蓋上塞子啟動磁力攪拌器，300r/min磁力攪拌20min。用無菌鑷子夾出布片并等待至布片無滴水，倒掉廣口玻璃瓶中的洗滌液，將布片放回廣口玻璃瓶內，再加入250mL的硬水蓋上塞子，300r/min磁力攪拌漂洗5min，漂洗過程中水溫同樣控制在（30±1）℃,以此方式漂洗2次。洗滌或漂洗過程中如果出現(xiàn)布片粘貼在玻璃瓶內壁、轉子失控、布片和轉子掛在一起等異?，F(xiàn)象可人工干預使其恢復正常。5.5.5.3漂洗完畢后用無菌鑷子取出3片染菌載體，等待至布片無滴水，逐片放入含30mL洗脫液的醫(yī)用無菌采樣杯中，旋緊瓶蓋，在渦旋震蕩器上混合60s，然后用PBS做10倍系列稀釋，并選擇適宜的稀釋度樣液1.0mL接種于無菌平皿，每個稀釋度接種2個平板。用冷卻至40℃~45℃的TSA培養(yǎng)基15mL～20mL作傾注，轉動平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉平皿36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h后，做活菌菌落計數(shù)（或根據所選菌種選用合適培養(yǎng)條件）。5.5.6空白對照組的處理以無菌硬水代替試驗產品，同時按上述步驟操作，作為空白對照組。5.5.7試驗次數(shù)試驗重復3次，取其算術平均值用于結果計算。5.6結果計算和評價4QB/TXXXX－XXXX5.6.1試驗結果有效性評價試驗結果有效性評價標準如下，當條件a)、b)中有任一條不滿足時試驗結果無效；當僅有條件c)不滿足時報告測試樣品無除菌效果；當同時滿足以下條件時，當次試驗結果有效可進行除菌率的計算。a)要求基線回收菌落數(shù)在106CFU/組～107CFU/組范圍內。b)活菌計數(shù)誤差評價符合QB/T2738—2023中7.2.6要求。c)3次測試3組試驗組的菌落回收對數(shù)值（lgTs）與3組空白對照組的菌落回收對數(shù)值（lgTo）進行比較。要求3次測試均滿足lgTs＜lgTo。5.6.2除菌率計算除菌率C按式（1）計算，結果以百分數(shù)表示，保留兩位小數(shù)C=×100%……（1）式中：C——測試樣品除菌率；Ⅰ——基線細菌回收平均菌落數(shù)；Ⅱ——試驗組洗滌后回收平均菌落數(shù)。5.6.3除菌效果評價當除菌率≥90%時，表明此條件下產品有除菌效果。6第二法肌膚清潔產品除菌效果評價方法6.1原理將試驗微生物懸浮液涂覆到載體上，模擬實際洗手過程用待測試樣處理染菌載體，再通過無菌操作回收載體表面殘留活菌。同時用無菌硬水處理染菌載體作為空白對照，用于試驗有效性評價指標。并對染菌載體進行基線回收，用于評價待測試樣的除菌效果。6.2儀器與設備6.2.1高壓蒸汽滅菌鍋。6.2.2恒溫培養(yǎng)箱：控溫精度±1℃。6.2.3濁度儀。6.2.4分析天平：精度為0.01g。6.2.5試管：?18mm×180m6.2.6移液槍：0.10mL，1mL，5mL，10mL。6.2.7培養(yǎng)皿：?90mm。6.2.8錐形瓶：500mL。6.2.9渦旋震蕩器。6.2.10無菌剪刀，鑷子。6.2.11無菌密封袋。6.2.12涂布棒。6.2.13無塵紙。6.2.14生物安全柜。6.3試劑6.3.1培養(yǎng)基商品化的合格市售培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基（TSB）、改良6.3.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）5QB/TXXXX—XXXX6.3.3硬水（硬度342mg/L）6.4評價原則6.4.1測試菌種金黃色葡萄球菌（ATCC6538）?？筛鶕a品的實際作用，增加測試菌株進行實驗。6.4.2測試載體仿真皮1以蛋白為主要原材料制作，一面光滑另一面粗糙的半透明薄膜，具有一定硬度，搓洗不破。仿真皮可通過紫外照射的方式進行滅菌。6.4.3菌落計數(shù)按GB4789.2中規(guī)定計數(shù)。6.5操作步驟6.5.1菌懸液的準備將傳代次數(shù)不超過5代的金黃色葡萄球菌（6.4.1）保藏菌株在合適的培養(yǎng)基如TSA上劃線，經（36±1）℃培養(yǎng)18h~24h。從平板上挑取一個單菌落接種到含30mLTSB的50mL無菌容器中，經（36±1）℃靜置培養(yǎng)18h~24h。要求濃度為5.0×108CFU/mL～1.0×109CFU/mL。6.5.2染菌載體的制備使用無菌剪刀將仿真皮（6.4.2）裁成6cm×6cm大小，平鋪于培養(yǎng)皿內，粗糙面朝上。在每塊仿真皮上接種0.10mL菌懸液，使用一次性涂布棒將菌液涂抹均勻，避免接觸仿真皮邊緣部位，于室溫下靜置30s，備用。6.5.3基線回收每3塊6.5.2制備好的染菌載體為1組，將1組染菌載體分別放入3個含10mLMLBTL采樣溶液的密封袋內均勻搓揉1min進行基線回收。6.5.4試驗組的處理6.5.4.1調整水溫為20℃~24℃,且水的流速為2.0L/min～4.0L/min，并保證整個清洗過程水溫和流速符合上述要求。水的潔凈度達到≤100CFU/mL的要求。6.5.4.2將染菌載體放置在硬質平板上。6.5.4.3對于香皂產品，用潤濕的香皂均勻涂擦染菌載體15s。對于液體類產品，用注射器吸取0.45mL樣品，均勻涂抹至染菌載體表面。6.5.4.4保持各個部位揉搓的一致性，揉搓染菌載體30s。6.5.4.5保持仿真皮和水流的夾角大約為120°,且出水處距離仿真皮頂端的垂直距離保持在5cm～7cm。依靠水的自然下流沖洗染菌載體30s，沖洗過程中通過左右移動平板確保所有部位均被沖洗到。6.5.4.6用無塵紙將沖洗完畢染菌載體上的水蘸干（不應搓擦，只需用紙巾輕輕拍打仿真皮即可）。6.5.4.7每個測試樣品洗滌1組6.5.2制備好的染菌載體。6.5.4.8每塊染菌載體在清洗后的1min內，放入含10mLMLBTL采樣溶液的密封袋內，均勻搓揉仿真皮1min。然后用PBS做10倍系列稀釋，并選擇適宜的稀釋度樣液1.0mL接種于無菌平皿，每個稀釋度接種2個平板。用冷卻至40℃~45℃的TSA培養(yǎng)基15mL～20mL作傾注，轉動平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉平皿36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h后，做活菌菌落計數(shù)。6.5.5空白對照組的處理均以0.45mL無菌硬水代替試驗產品，同時按上述步驟操作，作為空白對照組。6QB/TXXXX－XXXX6.5.6試驗次數(shù)試驗重復3次，取其算術平均值用于結果計算。6.6結果計算和評價6.6.1試驗結果有效性評價試驗結果有效性評價標準如下，當條件a)、b)中有任一條不滿足時試驗結果無效；當僅有條件c)不滿足時報告測試樣品無除菌效果；當同時滿足以下條件時，當次試驗結果有效可進行除菌率的計算。a)要求基線回收菌落數(shù)大于107CFU/組。b)活菌計數(shù)誤差評價符合QB/T2738—