DB21T 2211.2-2013 養(yǎng)殖貝類種質(zhì)檢測(cè)規(guī)程 第2部分染色體組型分析

ICS65.150B51DB21DB21/T2211.2—2013養(yǎng)殖貝類種質(zhì)檢測(cè)規(guī)程第2部分：染色體組型分析ThedetectionproceduresofshellfishgermplasmPart2:karyotypeanalysis遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2211.2—2013DB21/T****《養(yǎng)殖貝類種質(zhì)檢測(cè)規(guī)程》分為兩個(gè)部分：──第1部分：抽樣方法；──第2部分：染色體組型分析。本部分為DB21/T****的第2部分。本標(biāo)準(zhǔn)是按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由大連海洋大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由大連市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：大連海洋大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：丁君、常亞青、張靜、王軼南。本標(biāo)準(zhǔn)于2013年**月**日首次發(fā)布。1DB21/T2211.2—2013本部分規(guī)定了養(yǎng)殖貝類染色體組型分析的試劑、儀器和設(shè)備、玻片標(biāo)本制備和組型分析。2術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本部分：2.1胚胎細(xì)胞法取發(fā)育正常的養(yǎng)殖貝類原腸期胚胎或擔(dān)輪幼蟲，加入適量濃度的秋水仙素，使其胚胎細(xì)胞被阻抑在分裂中期而獲得養(yǎng)殖貝類染色體中期分裂相的方法。2.2體細(xì)胞法取鮮活的養(yǎng)殖貝類的鰓組織浸泡在適當(dāng)濃度的秋水仙素溶液中，使其體細(xì)胞被阻抑在分裂中期而獲得養(yǎng)殖貝類染色體中期分裂相的方法。2.3臂比染色體的長(zhǎng)臂長(zhǎng)度與短臂長(zhǎng)度之比。2.4次縊痕染色體上的縊縮部位。次縊痕的數(shù)量、位置和大小是染色體的重要形態(tài)特征。2.5隨體位于染色體末端的圓形或圓柱形的染色體片段,通過次縊痕與染色體主要部分相連。隨體是識(shí)別染色體的主要形態(tài)特征之一。3試劑、儀器、設(shè)備3.1試劑—卡諾固定液：甲醇與冰醋酸按3:1（v/v）的比例混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；—吉姆薩染液：1.5g吉姆薩粉末溶入50mL甘油中，置于60℃溫箱3h后，加入50mL中性甲醇，棕色瓶中保存。3.2儀器、設(shè)備—超凈工作臺(tái)；—天平（精度0.00001g2DB21/T2211.2—2013—顯微鏡（帶顯微照像）；—游標(biāo)卡尺（精度0.01mm—吸管、離心管、載玻片。4玻片標(biāo)本制備4.1胚胎細(xì)胞法4.1.1取樣吸管吸取發(fā)育正常的養(yǎng)殖貝類原腸期胚胎或擔(dān)輪幼蟲50個(gè)～100個(gè)，置于離心管中，加入50%滅菌海水配置的0.01%秋水仙素溶液，浸泡處理2h～3h。4.1.2低滲吸除秋水仙素溶液，加入0.075mol/L氯化鉀溶液低滲40min～50min。4.1.3固定吸除氯化鉀溶液，加入卡諾固定液5mL～8mL固定15min～20min。棄去固定液，加入新的卡諾固定液，重復(fù)固定4次后，置于冰箱冷凍室中(-l8℃)保存12h以上。4.1.4解離吸除上清液，在細(xì)胞懸液中加入50％的冰醋酸0.1mL～0.2mL，吸管吹打解離1min～2min。4.1.5滴片將干凈的載玻片放置在50℃~60℃的燈箱上。吸取細(xì)胞懸液，在距載玻片10cm～15cm高處滴2滴~3滴于載玻片上；或吸取細(xì)胞懸液在45°傾斜的冰凍載玻片滴2滴～3滴，并輕輕吹動(dòng)，使細(xì)胞鋪散開。將滴有細(xì)胞的玻片斜放靜置，自然干燥。4.1.6染色用磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）將吉姆薩溶液按9:1稀釋，將干燥后的玻片標(biāo)本在稀釋后的吉姆薩溶液中扣染，染色0.5h～1h后，自來(lái)水沖去染液，空氣干燥后用于組型分析。4.2體細(xì)胞法4.2.1取樣解剖取活體養(yǎng)殖貝類的鰓絲5條～10條，滅菌海水沖洗干凈后，剪刀剪碎置于離心管中，加入50%滅菌海水配置的0.04%秋水仙素溶液，浸泡處理0.5h～1h。4.2.2低滲吸除秋水仙素溶液，加入0.075mol/L氯化鉀溶液低滲30min～60min。4.2.3固定，解離，滴片，染色分別按4.1.3～4.1.6規(guī)定執(zhí)行。5組型分析3DB21/T2211.2—20135.1染色體數(shù)確定在油鏡下選取50個(gè)～100個(gè)分散良好，形態(tài)清晰，著絲粒清楚，兩條染色體單體適度分開的分裂相進(jìn)行顯微照像，沖印。計(jì)數(shù)染色體數(shù)目的眾數(shù)，計(jì)算眾數(shù)所占百分比，據(jù)此確定所檢測(cè)養(yǎng)殖貝類的染色體數(shù)。5.2染色體相對(duì)長(zhǎng)度計(jì)算游標(biāo)卡尺測(cè)量照片上每條染色體的長(zhǎng)度，根據(jù)公式：染色體相對(duì)長(zhǎng)度=（每條染色體長(zhǎng)度/單倍體組染色體總長(zhǎng)度）×100%，計(jì)算染色體相對(duì)長(zhǎng)度。5.3染色體分組和染色體組臂數(shù)計(jì)算5.3.1染色體分組游標(biāo)卡尺測(cè)量照片上每條染色體的長(zhǎng)臂和短臂長(zhǎng)度，計(jì)算每條染色體的臂比，按臂比將染色體分為—臂比1.00～1.70，為中部著絲粒染色體m組；—臂比1.71～3.00，為亞中部著絲粒染色體sm組；—臂比3.01～7.00，為亞端部著絲粒染色體st組；—臂比7.01~∞,為端部著絲粒染色體t組。5.3.2染色體組臂數(shù)計(jì)算中部和亞中部著絲粒染色體的臂數(shù)計(jì)為2，亞端部和端部著絲粒染色體的臂數(shù)計(jì)為1。染色體組臂數(shù)為各染色體臂數(shù)的總和。5.4核型公式根據(jù)確定的養(yǎng)殖貝類的染色體數(shù)，染色體分組情況和染色體組臂數(shù)，列出所檢測(cè)養(yǎng)殖貝類的核型公式。例如，某種貝類的核型公式：2n=38,18m+16sm+2st+2t,NF=72。5.5其他形態(tài)特征記錄觀測(cè)所檢測(cè)養(yǎng)殖貝類染色體的其他形態(tài)特征，有無(wú)