T-CBIA 011-2024 包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測方法

中國飲料工業(yè)協會發(fā)布I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)本文件由中國飲料工業(yè)協會提出。本文件由中國飲料工業(yè)協會團體標準技術工作委員會歸口。本文件起草單位：中國飲料工業(yè)協會、華潤怡寶飲料(中國)有限公司、農夫山泉股份有限公司、上?？底R食品科技有限公司、四川藍劍飲品集團有限公司、椰樹集團有限公司、青島嶗山礦泉水有限公司。本文件為首次發(fā)布。本文件知識產權歸屬中國飲料工業(yè)協會，本文件僅供中國飲料工業(yè)協會會員企業(yè)自愿使用。未經中國飲料工業(yè)協會同意，不得印刷、銷售。任何單位和個人使用本文件開展認證、檢測等活動應經中國飲料工業(yè)協會書面批準授權。Ⅱ本文件的發(fā)布機構提請注意，聲明符合本文件時，可能涉及ZL201910582662.7相關的專利的使用。本文件的發(fā)布機構對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機構承諾，他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權許可進行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機構備案。相關信息可以通過以下聯系方式獲得：專利持有人姓名：華潤怡寶飲料(中國)有限公司地址：廣東省深圳市南山區(qū)第五工業(yè)區(qū)朗山路怡寶食品飲料園請注意除上述專利外，本文件的某些內容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。1包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測方法1范圍本文件規(guī)定了包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速定性檢測方法。本文件適用于包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于GB4789.1食品安全國家標準食品微生物學檢驗總則GB8538食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法3原理銅綠假單胞菌是專性需氧微生物，CN液體培養(yǎng)基組合振蕩培養(yǎng)的方式可以為銅綠假單胞菌提供充分的營養(yǎng)條件和氧氣環(huán)境，通過測量培養(yǎng)液濁度可以客觀、便捷地識別微生物的生長狀態(tài)。萘啶酮酸等抗生素具有一定選擇性，可抑制除銅綠假單胞菌以外的革蘭氏陰性菌生長。對培養(yǎng)液劃線分離純化菌落后，通過生化或分子生物學等技術對可疑菌進行鑒定。4定義下列術語和定義適用于本文件。在實驗條件和操作方法與樣品保持一致的情況下，250mL無菌水經濾膜過濾，然后將濾膜置于50mLCN液體培養(yǎng)基中，在溫度36℃±1℃、轉速150r/min培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h后測得的培養(yǎng)液CN本底濁度值CNbackgroundNTU因萘啶酮酸不易溶于水，含有萘啶酮酸的CN液體培養(yǎng)基呈現微渾濁狀態(tài)。在培養(yǎng)過程中，具有孔狀結構的濾膜會改變CN液體培養(yǎng)基的濁度。萘啶酮酸和濾膜等背景濁度值會對檢測結果帶來干擾，因此將除微生物繁殖影響外的其他因素導致的濁度值定義為CN本底濁度值，其數值為過往累積試驗的陰性對照濁度值的平均數。5實驗室要求應符合GB4789.1中2實驗室基本要求等規(guī)定。2肉眼觀察樣品濁度>1.5倍陰性對照濁度值3等塑料包裝，再次用75%酒精等消毒劑對包裝容器口蓋處、外壁等充分擦拭消毒。9.2初篩培養(yǎng)9.2.1滅菌并組裝過濾系統(tǒng)在100級潔凈工作臺內進行無菌操作。將膜過濾系統(tǒng)過濾頭滅菌并降溫后，用無菌平頭無齒鑷子夾取無菌濾膜的邊緣部分，將濾膜網格面向上，貼放在已滅菌的過濾頭濾床面上，將無菌濾杯固定到已貼好濾膜的過濾頭上。9.2.2水樣采集對于瓶裝包裝水，在100級的潔凈工作臺內，宜對瓶口螺紋處灼燒消毒后，直接倒取250mL水樣至無菌濾杯內。對于大包裝飲用水，宜在100級潔凈環(huán)境中或使用100級潔凈保證的無菌采樣器，抽取250mL水樣并轉移到無菌濾杯內。如采樣過程無法在100級潔凈環(huán)境中進行，則需加強采樣過程環(huán)境控制及監(jiān)控，避免樣品受到環(huán)境污染，保證樣品有效性。9.2.3水樣過濾在100級潔凈工作臺內進行無菌操作。打開濾泵過濾水樣，待杯內水樣過濾完畢后，小心卸下過濾杯，用無菌平頭無齒鑷子夾取濾床上已過濾好的濾膜邊緣，轉移濾膜至裝有50mLCN液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，濾膜應完全與培養(yǎng)液接觸，不應粘貼在瓶內壁上。每批次檢測需做一個陰性對照，作為后續(xù)濁度判定的陰性參比樣。按照9.2.3的方法，過濾250mL無菌水并將該濾膜轉移至另一瓶50mLCN液體培養(yǎng)基中，作為陰性對照。將所有接種后的錐形瓶放置于溫度36℃±1℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱內，在轉速150r/min條件下，培養(yǎng)24h。9.2.6初篩判定9.2.6.1濁度觀察方法從培養(yǎng)箱中取出錐形瓶，將待觀察的錐形瓶對向明亮光源處，輕緩搖晃錐形瓶使培養(yǎng)液混勻，肉眼觀察培養(yǎng)液的濁度。9.2.6.2陰性對照濁度觀察按9.2.6.1觀察陰性對照，如陰性對照明顯表現為微生物繁殖的濁度，說明陰性對照受到污染，該次檢測無效，需排查原因。如陰性對照未明顯表現為微生物繁殖的濁度，僅呈現CN本底微渾濁狀態(tài)，則測量陰性對照濁度并判定。9.2.6.3檢測樣品濁度觀察按9.2.6.1逐一將檢測樣品和陰性對照對比，觀察兩者的濁度。如檢測樣品的濁度大于陰性對照，且明顯表現為有微生物繁殖的濁度，該樣品可直接判定為銅綠假單胞菌初篩可疑樣；反之，如檢測樣品與陰性對照的濁度無明顯差別，則測量樣品濁度并判定。9.2.6.4濁度測量濁度測量的采樣操作應在100級潔凈工作臺內進行。輕緩搖晃錐形瓶使培養(yǎng)液混勻，倒取或吸取一定量的培養(yǎng)液至潔凈干燥的比濁管中。9.2.6.5陰性對照濁度判定按9.2.6.4測量陰性對照的濁度，如陰性對照濁度值≤2倍CN本底濁度值，說明該批次檢測試驗有效，該陰性對照濁度值將作為本批次檢測樣品濁度判定的依據。4為2倍。9.2.6.6檢測樣品濁度判定對照濁度值，則該檢測樣品判定為銅綠假單胞菌初篩陰性樣。9.2.6.7初篩報告對于銅綠假單胞菌初篩可疑樣，需按9.3進行鑒定操作；對于銅綠假單胞菌初篩陰性樣，則報告250mL水樣中未檢出銅綠假單胞菌。9.3銅綠假單胞菌鑒定9.3.1平板劃線及培養(yǎng)輕緩搖晃銅綠假單胞菌初篩可疑樣的錐形瓶使培養(yǎng)液混勻，用無菌接種環(huán)蘸取培養(yǎng)液，于CN瓊脂平板上劃線，以分離純化單菌落。宜劃線1~3個平板。將平板倒置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)9.3.2生化確證試驗參照GB8538,分別在日光燈及360nm±20nm紫外燈下觀察CN瓊脂平板上生長的可疑菌落的顏色和熒光情況，按照菌落顏色及熒光情況選擇做相應的確證試驗，每種菌落表現類型選取不少于3個可疑菌落(當不足3個時，則全部挑取)做確證試驗。9.3.3其他鑒定法確證試驗挑取不少于5個可疑菌落(當不足5個時，則全部挑取),通過其他鑒定技術對可疑菌落進行確證，如基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)、16SrDNA測序等。按照9.3.2開展可疑菌落確證的，依據GB8538判定可疑菌落是否為銅綠假單胞菌。按照9.3.3開展可疑菌落確證的，根據各方法的規(guī)則判定可疑菌落是否為銅綠假單胞菌。對于陽性樣品，應依據GB8538進行最終結果確認。則，報告250mL水樣中未檢出銅綠假單胞菌。5A.1CN液體培養(yǎng)基CN補充成分15min。滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入溶于2mL滅菌蒸餾水的CN補充成分，培養(yǎng)基25℃的pH為7.1±0.2。宜現配現用。A.2CN瓊脂培養(yǎng)