(高清版)DB43∕T 954-2014 辣椒炭疽病室內(nèi)抗性鑒定技術(shù)規(guī)程

2014-10-21發(fā)布2014-11-20實施前言 Ⅱ 12術(shù)語和定義 13接種體準(zhǔn)備 13.1培養(yǎng)基制備 13.2接種體分離 2 23.4接種體保存 23.5接種體復(fù)壯 23.6接種孢子制備 24室內(nèi)抗性鑒定方法 3 34.2鑒定材料準(zhǔn)備 34.3鑒定室設(shè)置 34.4對照品種選擇 34.5接種方法 3 3 35.1調(diào)查時間 35.2調(diào)查方法 36抗病性評價 36.1評價標(biāo)準(zhǔn) 3 46.3抗性評價 4附錄A(資料性附錄)辣椒炭疽病的癥狀 5附錄B(資料性附錄)分離物菌落形態(tài)和分生孢子 6附錄C(規(guī)范性附錄)分離物PCR檢測方法 7附錄D(規(guī)范性附錄)辣椒抗炭疽病病情分級標(biāo)準(zhǔn)、評價標(biāo)準(zhǔn)、抗性評價統(tǒng)計表 工I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省植物保護(hù)研究所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：湖南省植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉勇、張卓、張德詠、譚新球、彭靜、羅路云、滿益龍。1辣椒炭疽病一般由5種病原菌引起，即紅色炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides=Gloeosporiumpiperatum),黑色炭疽病菌(C.coccodes=C.nigrum)、黑點炭疽病菌輪紋，上生小黑點的圓型或不規(guī)則型病斑，干燥時呈現(xiàn)膜狀且易破裂。病菌呈褪綠呈水漬狀，慢慢擴(kuò)大，病斑中間灰白色，周圍褐色。在果實上，漸擴(kuò)展為褐色凹陷，圓形或不規(guī)則形狀，病斑上生有黑點，為病原菌分生孢呈不規(guī)則或梭形病斑，縱裂凹陷。在我國辣椒種植區(qū)，辣椒炭疽病是一病后可引起(30～85)%產(chǎn)量損失(參見附錄A圖1)。2以L為列：稱取瓊脂(15～20)g,用自來水定容到1000mL,煮沸后用量筒盛或燒杯盛培養(yǎng)基，然后分裝在三角瓶或其他容器中121℃,滅菌30min后取出，冷卻后貯存?zhèn)溆谩Ｆ髦?21℃,滅菌30min后取出，冷卻后貯存?zhèn)溆?。的次氯酸鈉中浸泡2min,用滅菌水清洗3次后，用滅菌濾紙吸干病健塊的水分，用滅菌鑷子夾著病健參見附錄C.2),經(jīng)過對獲得的DNA進(jìn)行電泳分析，分離物的DNA提取成功(參見附錄C圖1),將分離物的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(定性參見附錄C.3),擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳檢測，獲得了1條550bp左右的清晰條帶(參見附錄C圖2),經(jīng)測序后得到的rDNAITS序列提交至GenBank,BLAST結(jié)果表明與紅心管上，于28℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)3d,在斜面上加一層滅菌礦物油(超過斜面頂部1cm)后置接種前需要進(jìn)行病原物接種體的復(fù)壯。常用的復(fù)壯方法為：將接種體培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上、于34室內(nèi)抗性鑒定方法4.1鑒定設(shè)計鑒定材料選擇紅色成熟果，每個品種或資源材料設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)一半接種用無菌水配制的病原菌分生孢子懸浮液1μ1(1×10?個/mL)、一半接種的無菌水1μl,每次重復(fù)不少于6個果。4.2鑒定材料準(zhǔn)備選取形狀和成熟度一致、無病無蟲危害的健康果實，將果實用清水洗凈，晾干干，放入75%的酒精中浸泡2min,用1%次氯酸鈉溶液中浸泡2min(2000mL燒杯),用無菌水洗3次(2000mL燒杯),然后在超凈工作臺中晾干。4.3鑒定室設(shè)置人工接種鑒定室應(yīng)具備人工控制溫度(0℃~50℃)、相對濕度(0%~100%)、光照(OLX~12000LX)4.4對照品種選擇以亞蔬中心提供的抗辣椒炭疽病品種PBC602和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所提供的感辣椒炭疽病品種茄門厚皮辣椒分別作為室內(nèi)抗病性鑒定的陽性和陰性對照品種，以各鑒定材料與對照相比的相對抗性來判定各鑒定材料的相對抗性。4.5接種方法在每個果實的中央部用微量注射器細(xì)刺破表皮后注入1μL用無菌水配制的病原菌分生孢子懸浮液當(dāng)全部接種完畢后，放入鑒定室內(nèi)28℃黑暗保濕(相對濕度為100%)24h,以后每天光照12h,相對濕度為(80～100)%,溫度控制在28℃。5.1調(diào)查時間接種后(5～7)d進(jìn)行病情調(diào)查按照附錄D表1對癥狀的描述，逐一觀察果實每一接種處的病斑擴(kuò)展情形，逐個果實觀察發(fā)病情況，記載各病級病果數(shù)，并將發(fā)病結(jié)果記入附錄D表3。6抗病性評價6.1.1以參鑒品種的病情指數(shù)分別與對照品種的病情指數(shù)進(jìn)行比較，以3次重復(fù)病情指數(shù)平均數(shù)與對4照病情指數(shù)進(jìn)行比較，以此作為抗性劃分依據(jù)。6.1.2在辣椒炭疽病抗性鑒定中，參鑒品種應(yīng)進(jìn)行3次鑒定實驗，實驗以感病對照品種的病情指數(shù)>30(該值為參考數(shù)值),參鑒品種的空白對照的病情指數(shù)為0,即參鑒品種空白對照果實不發(fā)病，該抗性6.2數(shù)據(jù)處理病情指數(shù)計算見式(2)6.3抗性評價根據(jù)品種3次鑒定實驗的平均病情指數(shù)，按照附錄D表2評價辣椒各品種的抗病性，并將結(jié)果統(tǒng)計在附錄D表35ab6附錄B(資料性附錄)將培養(yǎng)7d后的分離物進(jìn)行肉眼觀察，菌落形態(tài)剛開始為橙紅色，后變?yōu)楹稚蛏罨疑?，圓形，邊緣整齊，菌落輪紋的分界線明顯，菌絲呈白色，濕度大的情況下，菌落表面溢出淡紅色孢子堆。在電子顯微鏡下觀察其分生孢子盤無剛毛，分生孢子橢圓形，無色，單胞，大小為13.5×4.2Hm,符合辣椒炭疽菌的形態(tài)特征。圖1皿內(nèi)分離物菌落形態(tài)圖2分離物分生孢子7附錄C(規(guī)范性附錄)分離物PCR檢測方法C.1試劑及配方C.1.1TE緩沖液配方C.1.2DNA抽提液配方1%CTAB(w/v)(十六烷基三乙基溴化銨)C.1.4TAE電泳緩沖液(PH8.5)配方(50×)100μg/mL蛋白酶K冰乙酸20%(質(zhì)量濃度)Ficoll1.9%(質(zhì)量濃度)SDS0.25%(質(zhì)量濃度)溴酚藍(lán)將培養(yǎng)(5～7)d的分離物，用干凈滅菌手術(shù)刀刮菌絲與一干凈滅菌的1.5mL離心管中，加500H1TE緩沖液混勻，加入10%SDS溶液30H1和10mg/ml蛋白酶K(PK)3H1混勻，37℃水浴孵育1h℃水浴孵育1h。加入100μ1Nacl(5M)混勻。加入80H1CTAB/Nacl混勻，65℃水浴10min。加入等體積的氯仿/異戊醇混合液混勻，12000r/min離心15min。取上清至新1.5mL離心管。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液(25:24:1)混勻，12000r/min離心15min。取上清至新1.5mL離心管，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液混勻，12000r/min離心5min。取上清至新1.5mL離心管，加入2/3體積異丙醇，放入-20℃冰箱1h。12000r/min離心10min。去上清，用吸水紙吸干離心管口，沉淀用70%冷乙醇洗滌(輕輕來回倒置離心管)12000r/min離心10min。去上清，用吸水紙吸干離心管口，55℃干燥15min。緩沖液溶解DNA沉淀，用1%的瓊脂糖凝膠，按比例混勻電泳上樣緩沖液和DNA,將混有上樣緩沖液的DNA加至樣品孔中，用DNAMaker做分子量的標(biāo)記，進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)束后，在凝膠成像分析儀下觀察是否提取出DNA電泳帶，拍攝并記錄實驗結(jié)果，經(jīng)過對實驗結(jié)果的觀察，分離物DNA提取成功(見圖4),剩下的DNA在-20℃保存。8C.3.1PCR引物見表C.1表1檢測辣椒炭疽病的PCR引物引物名稱引物序列C.3.2辣椒炭疽菌采用的PCR反應(yīng)體系見表C.2TaqDNA聚合酶(2.5U/H1)引物TIS4(25μmol/H1)引物TIS5(25μmol/μ1)模板DNA(100/Hl)總體積C.3.3PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s;56℃退火30s,72℃延伸45s,進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min,并置于4℃保存。C.3.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳檢測，按比例混勻電泳上樣緩沖液和PCR產(chǎn)物，將混有上樣緩沖液的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加至樣品孔中，用DNAMaker做分子量的標(biāo)記，進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)束后，在凝膠成像9物的ITS片段均在(500~750)bp之間的一條特異性擴(kuò)增條帶(583bp),與預(yù)期目的片段長度基本一致(圖5)。相同(圖6)。Select:AllNoneSelected:0EJN198429.1附錄D(規(guī)范