DB45T 2103-2019 鴨圓環(huán)病毒檢測 聚合酶鏈式反應法

I本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由廣西壯族自治區(qū)農業(yè)農村廳提出。本標準由廣西畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：廣西壯族自治區(qū)動物疫病預防控制中心。本標準起草人：粟艷瓊、鄭敏、張步嫻、莫勝蘭、屈素潔、胡杰、尹彥文、鄒聯(lián)斌、施開創(chuàng)、李軍。1鴨圓環(huán)病毒檢測聚合酶鏈式反應法1范圍本標準規(guī)定了應用聚合酶鏈反應法檢測鴨圓環(huán)病毒(Duckcircovirus,DuCV)的生物安全措施、本標準適用于鴨圓環(huán)病毒(Duckcircovirus,DuCV)檢測。2規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541動物疫病實驗室檢驗采樣方法3術語和定義屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，無囊膜，單股環(huán)型DNA結構。主要是侵害宿主的免疫系統(tǒng)，而導聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction4生物安全措施2特異性引物引物序列參見附錄A.1。上、下游引物的使用濃度均為25pmol/HL。商品化DNA抽提試劑盒主要成分參見附錄B.2。商品化PCR試劑盒主要成分參見附錄B.3。電泳試劑如下：——瓊脂粉；——1×Tris-硼酸電泳緩沖液。其他試劑如下：6.1.6一次性耗材一次性耗材如下：——乳膠手套；——離心管；——吸頭。儀器設備如下：——電泳儀；——凝膠成像系統(tǒng)；37操作方法無菌采取待檢鴨的肝、腎、脾、肺、法氏囊等器官組織樣品各約2g,置于乳缽或玻璃研磨器中，充分研磨后，加入1mL無菌PBS(pH7.2);收集組織懸液反復凍融3次后，以3000r/min4℃離心5min,——2×TaqPCRMasterMix:——上游引物(25pmol/μL):0.5μL;——下游引物(25pmol/μL):0.5μL;加完試劑后瞬時離心混勻。將PCR反應管置于PCR儀內，反應程序為：94℃預變性3min;94℃40s,60℃30s,72℃2min,共35個循環(huán)；72℃延伸7mi7.4.11.2%瓊脂糖凝膠制備的1.2%凝膠：稱取1.2g瓊脂糖，加入100mL1×Tris-硼酸電泳緩沖液，煮沸溶解瓊脂糖。待瓊脂糖溶4DB45/T21緩沖液，使之沒過凝膠表面約2mm,輕輕拔出梳子，以備加樣電泳。7.4.2加樣以80V~100V穩(wěn)壓電泳，直至溴酚藍指示劑到達離瓊脂糖凝膠末端2cm~37.5注意事項7.5.1本操作程序應在無RNA酶的環(huán)境下和超凈工作臺中進行，并使用7.5.2離心管、PCR反應管、加樣吸頭應使用一次性塑料制品，使用前均應經DEPCH?O處理或直接購買無RNA酶產品，然后進行1.034×10?Pa高壓滅菌30min。8結果判定8.1將電泳后的瓊脂糖凝膠用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。陰性對照無任何DNA擴增帶，而陽性對照在8.2若被檢樣品在408bp位置出現(xiàn)DNA擴增帶，判定為鴨圓環(huán)病毒陽性。5(資料性附錄)引物序列及檢測結果判定A.1鴨圓環(huán)病毒特異性引物寡核苷酸序列引物序列見表A.1。表A.1鴨圓環(huán)病毒特異性引物序列引物名稱引物序列(5′→3′)片段大小(bp)A.2鴨圓環(huán)病毒PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖A.1。2:陰性對照。圖A.1鴨圓環(huán)病毒PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖6(資料性附錄)溶液的配制本附錄所用試劑均為分析純。B.2商品化DNA抽提試劑盒主要成分——細胞裂解液；——氯仿；——無水乙醇；——75%乙醇；——洗脫緩沖液；——過濾柱。B.3商品化PCR試劑盒主要成分商品化PCR試劑盒主要成分如下：——2×TapPCRMasterMix;B.4三羥甲基氨基甲烷(Tris)-硼酸電泳緩沖液配制B.4.15×Tris-硼酸電泳緩沖液配制——Tris:54g;——硼酸：27.5g;——0.5mol/LEDTA(pH8.0)——雙蒸水：定容至1000mL。在800mL雙蒸水中加入54gTris、27.5g硼酸和20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),磁力攪拌以確保其完全溶解，然后定容至1000mL,移至棕色瓶中。室溫保存。B.4.21×Tris-硼酸電泳緩沖液配制—5×Tris-硼酸電泳緩沖液：100mL;——雙蒸水：400mL。7在400mL雙蒸水中加入100mL5×Tris-硼酸電泳緩沖液，混勻。室溫保存。B.5PBS配制——氯化鈉：8g;——氯化鉀：0.2g;——磷酸氫二鈉：1.44g;——磷酸二氫鉀：0.24g;——雙蒸水：定容至1000mL。在800mL的雙蒸水中依次加入其余成分，用1mol/L鹽酸調節(jié)溶液的pH值至7.2,加雙蒸水定容至1000mL,1.034×10?Pa高壓滅菌25min。室溫保存。B.60.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制——DEPC:0.1mL;將0