紫外可見分光光度法

常用的含量測(cè)定的方法——

紫外—可見分光光度法什么是紫外—可見分光光度法？

紫外-可見分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)200～760nm波長(zhǎng)范圍的電磁波的吸收特征建立起來(lái)的光譜分析方法。其定量依據(jù)是Lambert-Beer.A=ELC紫外—可見分光光度法紫外分光光度計(jì)的構(gòu)造：紫外-可見分光光度計(jì)主要由光源、單色器、樣品室、檢測(cè)器、顯示系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。紫外—可見分光光度法

適用對(duì)象：

被測(cè)成分本身或其顯色產(chǎn)物對(duì)可見-紫外光具有選擇性吸收。如：總生物堿、總黃酮、總蒽醌、多糖等紫外—可見分光光度法

定量方法（單組分的定量方法）：吸收系數(shù)法選用溶劑應(yīng)不干擾被測(cè)組分的測(cè)定根據(jù)Beer定律A=εcl，若L和吸光系數(shù)ε或即可根據(jù)測(cè)得的A求出被測(cè)物的濃度

例如：維生素B12的水溶液在361nm處的值為207,盛于1cm吸收池中,測(cè)得溶液濃度為

c=0.414/(207×1)=0.00200(g/100ml)紫外—可見分光光度法2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法(工作曲線法)在單色光不純的情況下,測(cè)得的吸光度值可以隨所用儀器不同而在一個(gè)相當(dāng)大的幅度內(nèi)變化不定,若用吸光系數(shù)換算成濃度,則產(chǎn)生較大的誤差.但若是認(rèn)定一臺(tái)儀器,固定其工作狀態(tài)和測(cè)定條件,則濃度與吸光度之間的關(guān)系在很多情況下仍然可以是線性關(guān)系或近于線性的關(guān)系.即A=Kc紫外—可見分光光度法

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法(工作曲線法)但是此時(shí)K已不再是物質(zhì)的常數(shù)，不能用于定性依據(jù)。K值只是個(gè)別具體條件下的比例常數(shù)，不能互相通用。紫外—可見分光光度法3.對(duì)照法在同等條件下配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定波長(zhǎng)處，分別測(cè)量吸光度，根據(jù)Beer定律：As=EcslAx=Ecxl因是同種物質(zhì)、同臺(tái)儀器及同一波長(zhǎng)測(cè)定，故l和E相等，所以紫外—可見分光光度法紫外—分光光度法不僅可以測(cè)定試樣中組分的含量，而且還可用于弱酸（堿）的離解常數(shù)和配合平衡常數(shù)及配合物的組成：配制分析濃度為c的弱酸溶液，分別調(diào)節(jié)溶液pH，在測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，若在此波長(zhǎng)處HA與A－均有吸收，則在高酸（堿）度，該酸幾乎以HA（或A－）形式存在，此時(shí)溶液吸光度分別為：AHA=εHAc或AA-=εA-c當(dāng)溶液酸度在兩者之間時(shí)，根據(jù)吸光度的加和性，則紫外—可見分光光度法

特點(diǎn)：相對(duì)其他光譜分析方法來(lái)說(shuō)，其儀器設(shè)備和操作都比較簡(jiǎn)單，費(fèi)用少，分析速度快靈敏度高。如在紫外區(qū)直接檢測(cè)VC時(shí)，其最低檢出濃度可達(dá)到10-6g/ml.有較好的選擇性。通過(guò)適當(dāng)?shù)倪x擇測(cè)量條件，一般可在多種組分共存的體系中，對(duì)某一物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。精密度和準(zhǔn)確度較高。在儀器設(shè)備和其他測(cè)量條件較好的情況下，其相對(duì)誤差可減少到1%～2%?？捎糜趯?duì)微量組分的測(cè)定用途廣泛紫外—可見分光光度法實(shí)例：分光光度法測(cè)定總姜黃素的含量材料：姜黃素對(duì)照品、姜黃醇提物（姜黃經(jīng)乙醇提取，脫脂、干燥處理而得）、姜黃素膠囊測(cè)定條件的選擇將姜黃素對(duì)照品及姜黃醇提物用乙醇溶解后，在λ200～500nm處掃描，結(jié)果可見從300nm的峰谷到500nm的峰谷止，說(shuō)明姜黃醇提物在λ426nm處測(cè)定，很少或不受其他物質(zhì)干擾。見下圖1、2紫外—可見分光光度法

紫外—可見分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精取姜黃素對(duì)照品5、10、15、20、25μl于試管中，乙醇稀釋到4.00ml搖勻，用1ml比色皿，754分光光度計(jì)λ426nm處測(cè)定吸收度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并考察線性關(guān)系、線性范圍等。經(jīng)5次重復(fù)測(cè)定，得回歸方程：Y=0.03493X+0.0055.r=0.9998.總姜黃素濃度在1.25～6.25μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。紫外—可見分光光度法樣品的重復(fù)性考察取同一批樣品，經(jīng)5次稱量，重復(fù)測(cè)定，結(jié)果無(wú)論是姜黃醇提物或者制劑，重復(fù)性均很好，RSD<1.50%,見下表紫外—可見分光光度法精密度考察

取同一批試液，制備5復(fù)管平行測(cè)定，結(jié)果表明，精密度良好，RSD=0.84%紫外—可見分光光度法

注意事項(xiàng)1.試驗(yàn)中所用的量瓶和移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正、洗凈后使用。2.使用的